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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » WB结果不理想，呼唤帮助
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happy-j

银虫 (小有名气)

[求助] WB结果不理想，呼唤帮助

WESTERN BLOT新手，重复了好几次都快郁闷了。。。
第一张图是β-actin的结果，第一次的时候结果挺好的，可是不知道为什么最近几次都是这样，出来的条带不清楚而且很细。。。而且还有说不清的杂点，呼唤高手指点~~~
具体实验操作：
      从Hep G2细胞中用碧云天的中性裂解液提的蛋白，用的abmart的一抗，稀释比例1:4000（试用装，说明书中说可用1:5000做），二抗稀释比例1:4000。
    上样蛋白100ug/20ul
     分离胶浓度12%，电泳条件：100V，150min; 转膜条件：250mA, 70min; 5%脱脂奶粉封闭1h, 一抗4度孵育过夜


第二张图是硫酸转移酶蛋白的结果，蛋白源及提取方法、电泳、转膜条件如上。抗体应该没有问题，稀释比例按照说明进行。这个为什么条带之间界限不清楚，而且为什么在条带交际处显色较深？




[ Last edited by happy-j on 2011-5-17 at 23:59 ]
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1楼2011-05-17 23:58:07
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

314300420

捐助贵宾 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
lstt09nk(金币+6): 感谢参与，欢迎常来 2011-05-19 13:37:07
happy-j(金币+1): 第一次发帖求助，非常感谢提供解决意见。 2011-05-19 20:29:08
引用回帖:
Originally posted by happy-j at 2011-05-17 23:58:07:
WESTERN BLOT新手，重复了好几次都快郁闷了。。。
第一张图是β-actin的结果，第一次的时候结果挺好的，可是不知道为什么最近几次都是这样，出来的条带不清楚而且很细。。。而且还有说不清的杂点，呼唤高手指点~ ...

内参的抗体是不是回收使用了？现在天气比较热，抗体容易失活效价变低，而且会产生杂点和高背景，建议不要回收。根据你内参的结果分析，主要原因就是荧光强度低，可提高抗体浓度，另外使用的发光液的敏感性很重要，好的ECL发光液可以节省抗体，降低背景值，Millipore的效果很不错（货号WBKLS0500）。
第二张图的结果，分析认为是上样量过大，100ug/泳道，已经过载，超过了凝胶的分辨率，相邻孔的蛋白已经连在一起了，效果和没有梳子是一样的。你可以看看100ug的上样量，考马斯亮蓝染色的结果是什么样的，再对比下20ug的上样量是什么效果。
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3楼2011-05-19 09:41:41
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314300420

捐助贵宾 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
silicare(金币+3, EPI+1): 2011-05-20 17:03:51
引用回帖:
Originally posted by happy-j at 2011-05-19 20:39:40:
内参抗体没有回收使用，是新的抗体。用的发光液就是millipore,~~~~(>_<~~~~
之前做过上样量50ug/20ul的，但是结果跟上面的图差不多。。。然后有人建议可以调高上样量试试，所以...
再试一次，看会不 ...

先将SDS-PAGE跑的好看点(考马斯亮蓝染色)，转膜后用立春红染色(可以将结果扫描存着)，观察和考染的效果是否相当，最好把图贴上来会更直观些。
另外听楼主的意思，是没有做过预实验吧？抗体说明书给的建议稀释度都是一个范围，没有什么通用的稀释度的，不同的细胞(组织)相同蛋白的表达量也是不一样的，最好先做预实验，摸好合适的抗体浓度再做整张膜的正式实验。
附件里面有我做过实验的图片，可做为质控参考，
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乖乖宝贝
7楼2011-05-19 21:47:44
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普通回帖

happy-j

银虫 (小有名气)
木有人指点？呜呜，急求。。。
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2楼2011-05-18 21:37:46
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天涯萧客

金虫 (正式写手)

放羊大叔

【答案】应助回帖

★ ★
lstt09nk(金币+2): 鼓励 2011-05-19 13:37:32
比较脏，建议检测封闭液（可以先用BSA试试看会不会这样），或者把5%脱脂奶粉过滤。还有一个就像楼上说的一样，抗体问题。第二张图除了上述问题还有就是上样量太大，100ug，我们一样使30-40ug，除非比较难检的蛋白
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100年后地球照样转
4楼2011-05-19 11:33:40
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happy-j

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 314300420 at 2011-05-19 09:41:41:
内参的抗体是不是回收使用了？现在天气比较热，抗体容易失活效价变低，而且会产生杂点和高背景，建议不要回收。根据你内参的结果分析，主要原因就是荧光强度低，可提高抗体浓度，另外使用的发光液的敏感性很重 ...

内参抗体没有回收使用，是新的抗体。用的发光液就是millipore,~~~~(>_<~~~~
之前做过上样量50ug/20ul的，但是结果跟上面的图差不多。。。然后有人建议可以调高上样量试试，所以...
再试一次，看会不会改善吧。
谢谢^_^
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5楼2011-05-19 20:39:40
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happy-j

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 天涯萧客 at 2011-05-19 11:33:40:
比较脏，建议检测封闭液（可以先用BSA试试看会不会这样），或者把5%脱脂奶粉过滤。还有一个就像楼上说的一样，抗体问题。第二张图除了上述问题还有就是上样量太大，100ug，我们一样使30-40ug，除非比较难检的蛋白

嗯，好的。谢谢！
一步步做我的这个实验问题排查，期待尽快得到好结果
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6楼2011-05-19 20:40:45
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happy-j

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 314300420 at 2011-05-19 21:47:44:
先将SDS-PAGE跑的好看点(考马斯亮蓝染色)，转膜后用立春红染色(可以将结果扫描存着)，观察和考染的效果是否相当，最好把图贴上来会更直观些。
另外听楼主的意思，是没有做过预实验吧？抗体说明书给的建议稀释 ...

非常感谢您提供的实例参照，偶像~~

还有几个问题想问一下：

1、制备蛋白样品的时候，为什么要用RIPA来稀释呢？这个如果用ddH2Ol来调节蛋白浓度会有多大影响？

2、你用于蛋白抽提的RIPA是哪个公司的？配方是什么样的呢？我一直怀疑我的蛋白有问题，但是同实验的人用同样的RIPA做出来的结果比我的结果要好，所以不敢贸然更换RIPA，我用的是碧云天的

3、摸索一抗稀释倍数的时候一般如何设定？我之前有做过预实验，分别将稀释倍数设定为1:1000和1:1500，结果没有太大差别。说明书上给的建议是1:1000-1:2000.
另外，二抗的稀释倍数也需要摸索嘛？

再次感谢~~~

期待回复~~^_^
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8楼2011-05-20 23:36:44
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314300420

捐助贵宾 (著名写手)
1. 调整蛋白浓度的时候一般选择所用的裂解液来调整，一来可以保证体系里面的离子强度保持不变，二来因为裂解液里面含有诸如EDTA等可以抑制蛋白酶活性，可以尽量避免蛋白被降解，如果没有裂解液也可以用PBS稀释，至于用水稀释的影响，自己没有做过对比，所以也不清楚
2. 裂解液大概成分就是：50 mmol/L Tris-HCl (pH 7.5), 150 mmol/L NaCl, 1% NP-40, 0.5% sodium deoxycholate, 0.1% SDS, 0.02% NaN3, 1 mmol/L PMSF, and 10 µmol/L leupeptin ，个人认为裂解液问题几率比较小，你也说了其他人用着比你做的好
3. 预实验一抗浓度设定：一般建议1:1000~1:2000我就做一个最高值，一个最低值。范围要是广，像Epitomics的抗体很多都是1:1000~1:10000，就会做3个，1:1000, 1:2000, 1:5000，另外需要强调的是我使用的曝光系统是X胶片感光，你的应该是机器曝光的吧？感觉机器曝光灵敏度会差很多，所以你的抗体浓度可能会比建议的浓度要高些才行(自己验证了才知道)，梯度一般倍比，梯度差小了基本不会有变化的。
4.二抗第一次使用可以做个点膜的检测，按照倍比稀释后(TBST或PBST稀释)，取1ul，点到NC膜上，干燥后直接加ECL曝光，选择一个浓度(荧光不能弱，也不要太强，判断得有一定经验)，如图曝光30S，我会选择第3或者第4个浓度做为二抗使用浓度，以后不必摸索，直接使用。
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9楼2011-05-21 09:14:42
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happy-j

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 314300420 at 2011-05-21 09:14:42:
1. 调整蛋白浓度的时候一般选择所用的裂解液来调整，一来可以保证体系里面的离子强度保持不变，二来因为裂解液里面含有诸如EDTA等可以抑制蛋白酶活性，可以尽量避免蛋白被降解，如果没有裂解液也可以用PBS稀释，至 ...

再次，非常非常感谢！
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10楼2011-05-21 10:05:50
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