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WB结果不理想，呼唤帮助
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WESTERN BLOT新手，重复了好几次都快郁闷了。。。 第一张图是β-actin的结果，第一次的时候结果挺好的，可是不知道为什么最近几次都是这样，出来的条带不清楚而且很细。。。而且还有说不清的杂点，呼唤高手指点~~~ 具体实验操作： 从Hep G2细胞中用碧云天的中性裂解液提的蛋白，用的abmart的一抗，稀释比例1:4000（试用装，说明书中说可用1:5000做），二抗稀释比例1:4000。 上样蛋白100ug/20ul 分离胶浓度12%，电泳条件：100V，150min; 转膜条件：250mA, 70min; 5%脱脂奶粉封闭1h, 一抗4度孵育过夜 第二张图是硫酸转移酶蛋白的结果，蛋白源及提取方法、电泳、转膜条件如上。抗体应该没有问题，稀释比例按照说明进行。这个为什么条带之间界限不清楚，而且为什么在条带交际处显色较深？   [ Last edited by happy-j on 2011-5-17 at 23:59 ] |
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【答案】应助回帖
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lstt09nk(金币+6): 感谢参与，欢迎常来 2011-05-19 13:37:07
happy-j(金币+1): 第一次发帖求助，非常感谢提供解决意见。 2011-05-19 20:29:08
lstt09nk(金币+6): 感谢参与，欢迎常来 2011-05-19 13:37:07
happy-j(金币+1): 第一次发帖求助，非常感谢提供解决意见。 2011-05-19 20:29:08
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内参的抗体是不是回收使用了？现在天气比较热，抗体容易失活效价变低，而且会产生杂点和高背景，建议不要回收。根据你内参的结果分析，主要原因就是荧光强度低，可提高抗体浓度，另外使用的发光液的敏感性很重要，好的ECL发光液可以节省抗体，降低背景值，Millipore的效果很不错（货号WBKLS0500）。 第二张图的结果，分析认为是上样量过大，100ug/泳道，已经过载，超过了凝胶的分辨率，相邻孔的蛋白已经连在一起了，效果和没有梳子是一样的。你可以看看100ug的上样量，考马斯亮蓝染色的结果是什么样的，再对比下20ug的上样量是什么效果。 |
3楼2011-05-19 09:41:41
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乖乖宝贝7楼2011-05-19 21:47:44
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4楼2011-05-19 11:33:40
~~~~ 5楼2011-05-19 20:39:40
6楼2011-05-19 20:40:45
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非常感谢您提供的实例参照，偶像~~ 还有几个问题想问一下： 1、制备蛋白样品的时候，为什么要用RIPA来稀释呢？这个如果用ddH2Ol来调节蛋白浓度会有多大影响？ 2、你用于蛋白抽提的RIPA是哪个公司的？配方是什么样的呢？我一直怀疑我的蛋白有问题，但是同实验的人用同样的RIPA做出来的结果比我的结果要好，所以不敢贸然更换RIPA，我用的是碧云天的 3、摸索一抗稀释倍数的时候一般如何设定？我之前有做过预实验，分别将稀释倍数设定为1:1000和1:1500，结果没有太大差别。说明书上给的建议是1:1000-1:2000. 另外，二抗的稀释倍数也需要摸索嘛？ 再次感谢~~~ 期待回复~~^_^ |
8楼2011-05-20 23:36:44
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1. 调整蛋白浓度的时候一般选择所用的裂解液来调整，一来可以保证体系里面的离子强度保持不变，二来因为裂解液里面含有诸如EDTA等可以抑制蛋白酶活性，可以尽量避免蛋白被降解，如果没有裂解液也可以用PBS稀释，至于用水稀释的影响，自己没有做过对比，所以也不清楚 2. 裂解液大概成分就是：50 mmol/L Tris-HCl (pH 7.5), 150 mmol/L NaCl, 1% NP-40, 0.5% sodium deoxycholate, 0.1% SDS, 0.02% NaN3, 1 mmol/L PMSF, and 10 µmol/L leupeptin ，个人认为裂解液问题几率比较小，你也说了其他人用着比你做的好 3. 预实验一抗浓度设定：一般建议1:1000~1:2000我就做一个最高值，一个最低值。范围要是广，像Epitomics的抗体很多都是1:1000~1:10000，就会做3个，1:1000, 1:2000, 1:5000，另外需要强调的是我使用的曝光系统是X胶片感光，你的应该是机器曝光的吧？感觉机器曝光灵敏度会差很多，所以你的抗体浓度可能会比建议的浓度要高些才行(自己验证了才知道)，梯度一般倍比，梯度差小了基本不会有变化的。 4.二抗第一次使用可以做个点膜的检测，按照倍比稀释后(TBST或PBST稀释)，取1ul，点到NC膜上，干燥后直接加ECL曝光，选择一个浓度(荧光不能弱，也不要太强，判断得有一定经验)，如图曝光30S，我会选择第3或者第4个浓度做为二抗使用浓度，以后不必摸索，直接使用。  |
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