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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » WB结果不理想，呼唤帮助
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happy-j

银虫 (小有名气)
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Originally posted by 314300420 at 2011-05-21 09:14:42:
1. 调整蛋白浓度的时候一般选择所用的裂解液来调整，一来可以保证体系里面的离子强度保持不变，二来因为裂解液里面含有诸如EDTA等可以抑制蛋白酶活性，可以尽量避免蛋白被降解，如果没有裂解液也可以用PBS稀释，至 ...

不好意思，想再问你个问题。

请问，用BSA跟用脱脂牛奶封闭有很大的差别嘛？我做了个对比，但是不知道是我实验中其他环节出差别了呢还是确实是两个封闭液的差别，结果一个化学发光后效果很好，而另一个却没有任何条带，但是丽春红染色的时候两张膜上都有蛋白。求取经验值O(∩_∩)O~

您的分离胶以及浓缩胶的是提前一天配制还是当天配制当天跑胶？提前一天配胶跟当天配胶当天跑胶会有很大影响吗？如果提前一天制胶那如何保存？

另外，你能帮我看一下二抗点膜测试结果嘛，选择哪个点比较合适呢？
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11楼2011-05-23 14:49:30
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314300420

捐助贵宾 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by happy-j at 2011-05-23 14:49:30:
不好意思，想再问你个问题。

请问，用BSA跟用脱脂牛奶封闭有很大的差别嘛？我做了个对比，但是不知道是我实验中其他环节出差别了呢还是确实是两个封闭液的差别，结果一个化学发光后效果很好，而另一个却没有 ...

封闭效果绝大多数情况下BSA会好些，封闭充分，背景相对干净，相对来说还可以起到提高检测敏灵敏度的效果。对于检测一些磷酸化和糖基化蛋白时则通常只选择BSA而不选择奶粉，否则会产生高背景。
你的是奶粉封闭结果没有条带？可能奶粉本身质量不行，或者奶粉溶入TBST后PH值降低太多，导致抗体失活了。一般情况不会出现一个有一个没有的情况，但不排除特例，我用过Bioworld公司的E-Cadherin抗体，使用奶粉检测背景高，分子量位置不对，投诉反馈后他们建议使用BSA封闭，果然效果很好，条带特异，分子量正确，没有背景，当时感觉很神奇....
胶可以提前配，放在自封袋中，加点去离子水保湿，4℃放置一周使用没有问题
二抗使用第三个梯度就可以
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12楼2011-05-23 16:18:04
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happy-j

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 314300420 at 2011-05-23 16:18:04:
封闭效果绝大多数情况下BSA会好些，封闭充分，背景相对干净，相对来说还可以起到提高检测敏灵敏度的效果。对于检测一些磷酸化和糖基化蛋白时则通常只选择BSA而不选择奶粉，否则会产生高背景。
你的是奶粉封闭 ...

嗯，3Q~

好幸运，碰上了大侠O(∩_∩)O~
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13楼2011-05-23 16:38:23
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songguanghao

新虫 (初入文坛)
帮不上
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生命在于挑战！
14楼2011-05-25 13:04:07
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weizhe34

至尊木虫 (职业作家)
学习了，感谢
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15楼2011-06-03 21:11:57
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zplipeng

金虫 (著名写手)
引用回帖:
1楼: Originally posted by happy-j at 2011-05-17 23:58:07:
WESTERN BLOT新手，重复了好几次都快郁闷了。。。
第一张图是β-actin的结果，第一次的时候结果挺好的，可是不知道为什么最近几次都是这样，出来的条带不清楚而且很细。。。而且还有说不清的杂点，呼唤高手指点~ ...

楼主的WB结果做好了吗？我做蛋白磷酸化的探测，怎么也探测不到啊。
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加油哦↖(^ω^)↗，O(∩_∩)O哈哈~
16楼2011-12-12 20:21:21
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乖乖宝贝

金虫 (小有名气)
送鲜花一朵
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1336082楼: Originally posted by 314300420 at 2011-05-19 21:47:44
先将SDS-PAGE跑的好看点(考马斯亮蓝染色)，转膜后用立春红染色(可以将结果扫描存着)，观察和考染的效果是否相当，最好把图贴上来会更直观些。
另外听楼主的意思，是没有做过预实验吧？抗体说明书给的建议稀释度都 ...

你好！看了你的WB的实验，做得好漂亮哦。我想问问你哦，我最近做85KD的，买的是单抗CST的，结果做出来出现很多杂带，而且目标带与上下的杂带还会连在一起？做了几次每次都有杂带，估计是杂带避免不了，有什么办法使目标带与上下杂带不连起来吗？
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尽自己最大的努力，优秀毕业！
17楼2013-02-21 20:58:23
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314300420

捐助贵宾 (著名写手)
引用回帖:
1599143楼: Originally posted by 乖乖宝贝 at 2013-02-21 20:58:23
你好！看了你的WB的实验，做得好漂亮哦。我想问问你哦，我最近做85KD的，买的是单抗CST的，结果做出来出现很多杂带，而且目标带与上下的杂带还会连在一起？做了几次每次都有杂带，估计是杂带避免不了，有什么办法使 ...

85KD的蛋白，胶浓度选择需要相对低些才能起到比较好的分离效果，建议分离胶浓度使用8%，如果原来用的就是8%，只能通过延长电泳时间提高分离效果了，另外可以调整抗体稀释度，把杂带消除是上策
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乖乖宝贝
18楼2013-02-22 09:24:29
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乖乖宝贝

金虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
1599171楼: Originally posted by 314300420 at 2013-02-22 09:24:29
85KD的蛋白，胶浓度选择需要相对低些才能起到比较好的分离效果，建议分离胶浓度使用8%，如果原来用的就是8%，只能通过延长电泳时间提高分离效果了，另外可以调整抗体稀释度，把杂带消除是上策...

一张是转膜后丽春红染膜，85KD的转膜应该可以了，但是封闭，抗体孵育曝光，很多杂带，表达也很高，最重要是目标条带和上下杂带连在一起了。一抗浓度稀释后，杂带仍然没有消失，现在就想办法把目标和杂带尽量分开些……我用的是10%的胶，明天用8%的试试看

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尽自己最大的努力，优秀毕业！
19楼2013-02-22 12:22:12
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314300420

捐助贵宾 (著名写手)
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1599205楼: Originally posted by 乖乖宝贝 at 2013-02-22 12:22:12
一张是转膜后丽春红染膜，85KD的转膜应该可以了，但是封闭，抗体孵育曝光，很多杂带，表达也很高，最重要是目标条带和上下杂带连在一起了。一抗浓度稀释后，杂带仍然没有消失，现在就想办法把目标和杂带尽量分开些 ...

可以继续稀释抗体，不知道你的蛋白样品是什么，如果是纯蛋白还可以降低上样量，相信可以调整出单条带的结果
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20楼2013-02-22 20:55:30
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