| 查看: 4953 | 回复: 20 | |||
| 本帖产生 1 个 BioEPI ，点击这里进行查看 | |||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | |||
[求助]
WB结果不理想，呼唤帮助
|
|||
|
WESTERN BLOT新手，重复了好几次都快郁闷了。。。 第一张图是β-actin的结果，第一次的时候结果挺好的，可是不知道为什么最近几次都是这样，出来的条带不清楚而且很细。。。而且还有说不清的杂点，呼唤高手指点~~~ 具体实验操作： 从Hep G2细胞中用碧云天的中性裂解液提的蛋白，用的abmart的一抗，稀释比例1:4000（试用装，说明书中说可用1:5000做），二抗稀释比例1:4000。 上样蛋白100ug/20ul 分离胶浓度12%，电泳条件：100V，150min; 转膜条件：250mA, 70min; 5%脱脂奶粉封闭1h, 一抗4度孵育过夜 第二张图是硫酸转移酶蛋白的结果，蛋白源及提取方法、电泳、转膜条件如上。抗体应该没有问题，稀释比例按照说明进行。这个为什么条带之间界限不清楚，而且为什么在条带交际处显色较深？   [ Last edited by happy-j on 2011-5-17 at 23:59 ] |
回复此楼» 猜你喜欢
2027广东省杰青
已经有5人回复
-
快农历七夕节了，轻松一下，男人悄悄话，女施主请不要进来。
已经有3人回复
-
哪位老哥知道今年的国自然具体哪一天放榜？
已经有9人回复
-
欢迎发来filecode的Mz6后的代码验证其规律
已经有72人回复
-
咱们一起用铁证分析2026国家社科基金中标与否
已经有26人回复
-
我的国基提前知道中了，可是同事的操作让我实在接受不了，怎么会有这样的人
已经有16人回复
-
有时候，自然基金真的不能太认真 （我的申报经验）
已经有12人回复
-
招聘 金属平磨液，抛光液研发工程师
已经有3人回复
-
时间戳又变了8-15
已经有23人回复
-
filecode=后面第一个是大写字母
已经有7人回复
314300420
捐助贵宾 (著名写手)
- BioEPI: 3
- 应助: 16 (小学生)
- 金币: 2193.1
- 散金: 2458
- 红花: 17
- 帖子: 1447
- 在线: 511.5小时
- 虫号: 851254
- 注册: 2009-09-18
- 性别: GG
- 专业: 抗体工程学
|
封闭效果绝大多数情况下BSA会好些，封闭充分，背景相对干净，相对来说还可以起到提高检测敏灵敏度的效果。对于检测一些磷酸化和糖基化蛋白时则通常只选择BSA而不选择奶粉，否则会产生高背景。 你的是奶粉封闭结果没有条带？可能奶粉本身质量不行，或者奶粉溶入TBST后PH值降低太多，导致抗体失活了。一般情况不会出现一个有一个没有的情况，但不排除特例，我用过Bioworld公司的E-Cadherin抗体，使用奶粉检测背景高，分子量位置不对，投诉反馈后他们建议使用BSA封闭，果然效果很好，条带特异，分子量正确，没有背景，当时感觉很神奇.... 胶可以提前配，放在自封袋中，加点去离子水保湿，4℃放置一周使用没有问题 二抗使用第三个梯度就可以 |
12楼2011-05-23 16:18:04
2楼2011-05-18 21:37:46
314300420
捐助贵宾 (著名写手)
- BioEPI: 3
- 应助: 16 (小学生)
- 金币: 2193.1
- 散金: 2458
- 红花: 17
- 帖子: 1447
- 在线: 511.5小时
- 虫号: 851254
- 注册: 2009-09-18
- 性别: GG
- 专业: 抗体工程学
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★
lstt09nk(金币+6): 感谢参与，欢迎常来 2011-05-19 13:37:07
happy-j(金币+1): 第一次发帖求助，非常感谢提供解决意见。 2011-05-19 20:29:08
lstt09nk(金币+6): 感谢参与，欢迎常来 2011-05-19 13:37:07
happy-j(金币+1): 第一次发帖求助，非常感谢提供解决意见。 2011-05-19 20:29:08
|
内参的抗体是不是回收使用了？现在天气比较热，抗体容易失活效价变低，而且会产生杂点和高背景，建议不要回收。根据你内参的结果分析，主要原因就是荧光强度低，可提高抗体浓度，另外使用的发光液的敏感性很重要，好的ECL发光液可以节省抗体，降低背景值，Millipore的效果很不错（货号WBKLS0500）。 第二张图的结果，分析认为是上样量过大，100ug/泳道，已经过载，超过了凝胶的分辨率，相邻孔的蛋白已经连在一起了，效果和没有梳子是一样的。你可以看看100ug的上样量，考马斯亮蓝染色的结果是什么样的，再对比下20ug的上样量是什么效果。 |
3楼2011-05-19 09:41:41
天涯萧客
金虫 (正式写手)
放羊大叔
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 1038.3
- 散金: 15
- 帖子: 353
- 在线: 166.2小时
- 虫号: 756987
- 注册: 2009-04-25
- 性别: GG
- 专业: 神经生物学
4楼2011-05-19 11:33:40
