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WB结果不理想，呼唤帮助
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WESTERN BLOT新手，重复了好几次都快郁闷了。。。 第一张图是β-actin的结果，第一次的时候结果挺好的，可是不知道为什么最近几次都是这样，出来的条带不清楚而且很细。。。而且还有说不清的杂点，呼唤高手指点~~~ 具体实验操作： 从Hep G2细胞中用碧云天的中性裂解液提的蛋白，用的abmart的一抗，稀释比例1:4000（试用装，说明书中说可用1:5000做），二抗稀释比例1:4000。 上样蛋白100ug/20ul 分离胶浓度12%，电泳条件：100V，150min; 转膜条件：250mA, 70min; 5%脱脂奶粉封闭1h, 一抗4度孵育过夜 第二张图是硫酸转移酶蛋白的结果，蛋白源及提取方法、电泳、转膜条件如上。抗体应该没有问题，稀释比例按照说明进行。这个为什么条带之间界限不清楚，而且为什么在条带交际处显色较深？   [ Last edited by happy-j on 2011-5-17 at 23:59 ] |
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2楼2011-05-18 21:37:46
~~~~ 5楼2011-05-19 20:39:40
6楼2011-05-19 20:40:45
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非常感谢您提供的实例参照，偶像~~ 还有几个问题想问一下： 1、制备蛋白样品的时候，为什么要用RIPA来稀释呢？这个如果用ddH2Ol来调节蛋白浓度会有多大影响？ 2、你用于蛋白抽提的RIPA是哪个公司的？配方是什么样的呢？我一直怀疑我的蛋白有问题，但是同实验的人用同样的RIPA做出来的结果比我的结果要好，所以不敢贸然更换RIPA，我用的是碧云天的 3、摸索一抗稀释倍数的时候一般如何设定？我之前有做过预实验，分别将稀释倍数设定为1:1000和1:1500，结果没有太大差别。说明书上给的建议是1:1000-1:2000. 另外，二抗的稀释倍数也需要摸索嘛？ 再次感谢~~~ 期待回复~~^_^ |
8楼2011-05-20 23:36:44
10楼2011-05-21 10:05:50
11楼2011-05-23 14:49:30
13楼2011-05-23 16:38:23