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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 综合其他 » 【求助/交流】WB老做不出来
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水水726

新虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】WB老做不出来 已有4人参与

最近开始做WB，先用Tublin练手，但是老是做不出来，郁闷！
  分离胶是10%，浓缩胶5%，电泳：80V半小时至分离胶，120v一个半小时分  
  离。
  转膜:湿转300mA，2小时
  第一次用了回收的一抗出现3条带，后来换了新的一抗，出现2条条带，郁闷，不知道为什么？？？求高手指点，注：一抗是单克隆抗体，从别的实验室分装了10ul拿过来用的。。。。
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1楼 2011-01-01 21:41:39
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翱宇

禁虫 (正式写手)

将军
★ ★ ★
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1949stone(金币+2):谢谢交流 2011-01-01 22:32:04
你上蛋白marker了吗？tublin是对照，一般能做出来的，几条带倒是无所谓，主要是对照蛋白marker看你要的条带出现了否，
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2楼2011-01-01 21:49:54
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cpuyao

木虫 (小有名气)
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1949stone(金币+2):鼓励交流 2011-01-01 22:32:23
条件还是可以的，别的实验室用此抗体是单一条带嘛，蛋白是否降解了呢？注意蛋白提取的过程要全部冰上操作及避免蛋白反复冻融
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3楼2011-01-01 22:21:32
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shaquila

金虫 (正式写手)
★ ★
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1949stone(金币+1):谢谢交流 2011-01-01 22:32:38
没做过WB，不知道微管蛋白的性质 .但是看文章有多条带，有可能是多聚体
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4楼2011-01-01 22:32:00
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水水726

新虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by cpuyao at 2011-01-01 22:21:32:
条件还是可以的，别的实验室用此抗体是单一条带嘛，蛋白是否降解了呢？注意蛋白提取的过程要全部冰上操作及避免蛋白反复冻融

蛋白没有降解，我的蛋白样品在其他实验室验证了下，没有问题
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5楼2011-01-01 22:56:35
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水水726

新虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 翱宇 at 2011-01-01 21:49:54:
你上蛋白marker了吗？tublin是对照，一般能做出来的，几条带倒是无所谓，主要是对照蛋白marker看你要的条带出现了否，

问题是不该出现非特异性结合条带啊，marker是上了。。。
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6楼2011-01-01 22:58:12
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cpuyao

木虫 (小有名气)
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dhd997(金币+2):鼓励交流 2011-01-02 13:16:55
引用回帖:
Originally posted by 水水726 at 2011-01-01 22:58:12:

问题是不该出现非特异性结合条带啊，marker是上了。。。

单克隆抗体也是可能出现非特异条带的，如蛋白降解或者产生多聚体，既然蛋白没问题可能是一抗质量不好，楼主可以适当延长封闭时间，或者增加一抗稀释比例试一试，个人意见，仅供参考^^祝好运
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7楼2011-01-02 00:21:34
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