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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » WB蛋白定量
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水水726

新虫 (小有名气)

[交流] WB蛋白定量 已有3人参与

每次提完蛋白进行含量测定，bradford法，做WB时都发现内参不一致，然后从-70取出一部分蛋白重新测定，都能发现与第一次测的含量有偏差。。汗哪！难道现提的蛋白要先储存一天才能再测？？求高手指点！
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【分子生物】EPI帖 蛋白质生物学实验经验

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1楼 2011-05-07 23:48:38
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shenhaiwang

金虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★ ★ ★
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dhd997(金币+5, EPI+1): good 2011-05-08 15:24:01
bradford法有其优点，但是去污剂、Triton-100、SDS和0.1MNaOH等干扰物质都会对其检测结果产生影响。如果要求比较严格的话，加入试剂后的5——20min内颜色是最稳定的，最好在这段时间内测定吸光值。另外，不知道楼主所用的紫外分光光度计是什么样子的，有些仪器本身误差就比较大，前后测量的结果都有可能有较大的差别，建议用其他比较准确的仪器再试一下。最后，如果楼主实验操作规范，仪器没有问题的话，那很有可能是样品的问题，可能是样品蛋白不稳定，经过冻融以后，出现溶解度下降等情况；这样的话，在测定之前，应该充分震荡一下，在进行测定。一点愚见，希望对楼主有所帮助！
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2楼2011-05-08 13:29:57
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水水726

新虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by shenhaiwang at 2011-05-08 13:29:57:
bradford法有其优点，但是去污剂、Triton-100、SDS和0.1MNaOH等干扰物质都会对其检测结果产生影响。如果要求比较严格的话，加入试剂后的5——20min内颜色是最稳定的，最好在这段时间内测定吸光值。另外，不知道楼 ...

用酶标仪测的，并无这些干扰剂，发现内参不齐后，再去重测，一般间隔一天吧，发现有的样品与前一天测的无变化，有的却变化很大，纠结，郁闷
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3楼2011-05-08 17:26:35
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314300420

捐助贵宾 (著名写手)
★ ★ ★ ★
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dhd997(金币+3): good 2011-05-09 08:00:50
可以试试BCA定量，试剂盒不贵，操作也很方便。
定量不稳定，是不是样品浓度过低，或者过高？样品浓度过低不稳定就很正常了，因为在那个范围内，误差对结果的影响很大。过高了，需要把样品稀释到标准曲线范围内测定才有效。楼主提取的是细胞样品？还是组织样品？定量后浓度范围是多少？
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4楼2011-05-08 22:36:53
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水水726

新虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 314300420 at 2011-05-08 22:36:53:
可以试试BCA定量，试剂盒不贵，操作也很方便。
定量不稳定，是不是样品浓度过低，或者过高？样品浓度过低不稳定就很正常了，因为在那个范围内，误差对结果的影响很大。过高了，需要把样品稀释到标准曲线范围内测 ...

一般浓度是八至十几ug/ul吧，不会超过15吧。。。应该不低了吧。。。，同一批样品中总有几个有变动的，纠结啊。。。
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5楼2011-05-08 23:25:33
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linyingjia

至尊木虫 (职业作家)
★ ★
西瓜(金币+2): Good！头像是本人？帅噢 2011-05-09 22:18:11
bca定量能好些     冻存后的蛋白可能也有降解    好的数据最好不要冻
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6楼2011-05-09 21:43:55
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水水726

新虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by linyingjia at 2011-05-09 21:43:55:
bca定量能好些     冻存后的蛋白可能也有降解    好的数据最好不要冻

我都是提完立刻测蛋白含量的啊，然后做WB就发现内参不整齐,只能把冻存的蛋白拿出来再测一遍
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7楼2011-05-10 09:07:39
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linyingjia

至尊木虫 (职业作家)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
Originally posted by 水水726 at 2011-05-10 09:07:39:
我都是提完立刻测蛋白含量的啊，然后做WB就发现内参不整齐,只能把冻存的蛋白拿出来再测一遍

哦   我们是bca定量的   r大概0.99以上
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8楼2011-05-10 09:28:50
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