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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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水水726

新虫 (小有名气)

[交流] WB蛋白定量 已有3人参与

每次提完蛋白进行含量测定,bradford法,做WB时都发现内参不一致,然后从-70取出一部分蛋白重新测定,都能发现与第一次测的含量有偏差。。汗哪!难道现提的蛋白要先储存一天才能再测??求高手指点!
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shenhaiwang

金虫 (小有名气)

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dhd997(金币+5, EPI+1): good 2011-05-08 15:24:01
bradford法有其优点,但是去污剂、Triton-100、SDS和0.1MNaOH等干扰物质都会对其检测结果产生影响。如果要求比较严格的话,加入试剂后的5——20min内颜色是最稳定的,最好在这段时间内测定吸光值。另外,不知道楼主所用的紫外分光光度计是什么样子的,有些仪器本身误差就比较大,前后测量的结果都有可能有较大的差别,建议用其他比较准确的仪器再试一下。最后,如果楼主实验操作规范,仪器没有问题的话,那很有可能是样品的问题,可能是样品蛋白不稳定,经过冻融以后,出现溶解度下降等情况;这样的话,在测定之前,应该充分震荡一下,在进行测定。一点愚见,希望对楼主有所帮助!
2楼2011-05-08 13:29:57
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水水726

新虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by shenhaiwang at 2011-05-08 13:29:57:
bradford法有其优点,但是去污剂、Triton-100、SDS和0.1MNaOH等干扰物质都会对其检测结果产生影响。如果要求比较严格的话,加入试剂后的5——20min内颜色是最稳定的,最好在这段时间内测定吸光值。另外,不知道楼 ...

用酶标仪测的,并无这些干扰剂,发现内参不齐后,再去重测,一般间隔一天吧,发现有的样品与前一天测的无变化,有的却变化很大,纠结,郁闷
3楼2011-05-08 17:26:35
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314300420

捐助贵宾 (著名写手)

★ ★ ★ ★
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dhd997(金币+3): good 2011-05-09 08:00:50
可以试试BCA定量,试剂盒不贵,操作也很方便。
定量不稳定,是不是样品浓度过低,或者过高?样品浓度过低不稳定就很正常了,因为在那个范围内,误差对结果的影响很大。过高了,需要把样品稀释到标准曲线范围内测定才有效。楼主提取的是细胞样品?还是组织样品?定量后浓度范围是多少?
4楼2011-05-08 22:36:53
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水水726

新虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by 314300420 at 2011-05-08 22:36:53:
可以试试BCA定量,试剂盒不贵,操作也很方便。
定量不稳定,是不是样品浓度过低,或者过高?样品浓度过低不稳定就很正常了,因为在那个范围内,误差对结果的影响很大。过高了,需要把样品稀释到标准曲线范围内测 ...

一般浓度是八至十几ug/ul吧,不会超过15吧。。。应该不低了吧。。。,同一批样品中总有几个有变动的,纠结啊。。。
5楼2011-05-08 23:25:33
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linyingjia

至尊木虫 (职业作家)

★ ★
西瓜(金币+2): Good!头像是本人?帅噢 2011-05-09 22:18:11
bca定量能好些     冻存后的蛋白可能也有降解    好的数据最好不要冻
6楼2011-05-09 21:43:55
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水水726

新虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by linyingjia at 2011-05-09 21:43:55:
bca定量能好些     冻存后的蛋白可能也有降解    好的数据最好不要冻

我都是提完立刻测蛋白含量的啊,然后做WB就发现内参不整齐,只能把冻存的蛋白拿出来再测一遍
7楼2011-05-10 09:07:39
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linyingjia

至尊木虫 (职业作家)


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引用回帖:
Originally posted by 水水726 at 2011-05-10 09:07:39:
我都是提完立刻测蛋白含量的啊,然后做WB就发现内参不整齐,只能把冻存的蛋白拿出来再测一遍

哦   我们是bca定量的   r大概0.99以上
8楼2011-05-10 09:28:50
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