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xiajing_acm

新虫 (小有名气)

[求助] 关于Western的许多不明白与不清楚的地方

给位大侠：
你们好！
我刚开始做western，试验中碰到许多问题，劳驾帮我一下，非常感谢！
我做的蛋白包括p21（21KD）、CyclinD1（37KD）、HDAC3（49KD）、HDAC4（119KD）及内参beta-actin（42KD）。
1、关于加样及电泳：因为我做的大部分是核蛋白，所以提核蛋白做的。可核蛋白浓度每次提的都很低，最小的只有0.65ug/ul左右，1mm的梳子(最大上样量44ul)最多大约只能加20ug，不知道上样量是不是不够呢？上样的时候总有样品溢出污染另一孔，对于上大体积的样大家有好的加样方法吗？p21较小，电泳的时候跑到底20KD Marker都看不清楚，该如何判断是否已经跑开了呢？
2、关于转膜：我用的湿转0.45umPVDF膜，第一次用250mA转2h，发现预染Marker已经转到滤纸上了，可曝光内参条带还比较清晰，p21没有条带；第二次用250mA转1h，p21隐约有条带，而250mA转2h发现CyclinD1与HDAC3却没有条带。请教下大家：预染Marker转到滤纸上就证明蛋白转过了吗？我到底该如何选择p21（21KD）、CyclinD1（37KD）、HDAC3（49KD）、HDAC4（119KD）及内参beta-actin（42KD）的转膜条件呢？
3、一抗孵育：这里要说一下，我的抗体p21与CyclinD1是Santa的，p21已经过了1年零8个月的样子，CyclinD1快到一年；HDAC3与HDAC4是CST的，超过送货期1年8个月了，不知道做的效果不好是不是跟抗体过期有关啊？可是内参时间也过了很久能做出来啊，这是怎么回事呢？是ProteinTech的！怎样检验一抗是否过期及效价呢？还有，没有热熔机该如何孵育一抗呢？室温还是4度过夜？
4、发光及显影：发光液加到膜上一般发光多久曝光呢？尤其是看不到荧光的情况下？是不是等一段时间啊？我用的是Pierce的SuperSignal Substrate！有时候加发光液后整个膜发亮，但不见荧光条带是怎么回事呢？还有，曝光的时间一般多少比较好啊？
问题太多，希望大家帮帮忙啊！谢谢啦！
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1楼2011-10-17 09:49:19
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liangzi3241

金虫 (著名写手)
★ ★
wanhscn(金币+2): 鼓励交流 2011-10-23 11:18:40
首先，你提取的蛋白量太少了，样品不好的话，后面的步骤做的再好也是个白搭。建议从制备样品上下功夫，看看试剂盒是不是有问题。转膜条件需要自己摸索，多做才能发现规律。一抗是否结合好至关重要，一抗结合不好，二抗和谁结合呢？建议过期抗体扔掉。加曝光液后整个莫发亮，有可能时你洗膜没有洗干净。做western不好做，要用心，祝顺利。
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2楼2011-10-18 15:20:38
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fisheart

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

xiajing_acm(金币+5): 2011-10-20 20:07:19
1 不知道你是用什么方法提蛋白的，蛋白量低，可以通过扩大细胞培养，多裂些细胞。上样，尽量不用全部上满，上样速度快点，否则样品会漂的。电泳时间当然是看marker了，跑 p21这样的小蛋白，胶配浓一些的，用12%的，以及 marker看不清楚是什么意思@@预染marker就是让你看大小决定电泳什么时候停止的
2 转膜时间是根据目标蛋白的大小来看的，不可能一个条件所有大小蛋白质都是最好条件，大分子量蛋白要转时间长否则不充分，小分子量蛋白要转短，否则容易转过，这个还要结合上样量和蛋白质表达的量，marker转到滤纸，内参还有信号，是因为内参本身表达量就高，留在膜里的部分就相当多，自然能检测到信号。可以先试试100V转1：30min，根据结果适当调整，如果蛋白信号差距大，建议分开转膜。
3 不同的抗体性质不一样，有些过期很多年都没关系，可以先过量使用一抗体，看看有没有信号。正常的孵育时间室温1h, 或者4度过夜都可以，4度过夜效果好些。
4  发光液孵育时间看说明书，曝光时间是根据信号强弱调整的
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3楼2011-10-18 15:59:58
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telomerase

至尊木虫 (著名写手)

cain
★
wanhscn(金币+1): 鼓励交流 2011-10-23 11:18:19
关于转膜：内参条带还比较清晰，p21没有条带，内参大于P21可能，p21转过了；p21隐约有条带，而250mA转2h发现CyclinD1与HDAC3却没有条带，因该是转的时间不到。具体条件你得摸下

一抗，4度过夜较好，先浓一点做出条带来再优化。特异性好不好，你得检测下，最好使用文献报道的或其他实验室做了没问题的抗体，否则不太好做出来。至于过期应该不是太大的问题，只要不是过期很久就可以，多加些就是了。
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我的路靠我的脚踩出来！！！不走寻常路！！！
4楼2011-10-18 16:55:36
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飞雪流萤

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
wanhscn(金币+3): 鼓励应助！ 2011-10-23 11:18:30
xiajing_acm(金币+45): 5 2011-10-24 10:07:49
1.一般电泳仪应该配套1.5mm的梳子吧，20μg的蛋白量可以吧，我做的上30μg的上样量曝光时间很短的，还有楼主的上样枪头是不是那种很长的，那种的好用些。我做过分力量为23左右的蛋白，用的是12%的胶，maker可以适当加量吧，应该挺清楚地。
2.我转膜时用的是106v的恒压，问题不大（目的蛋白最低23，最高95）不知是不是用于你的实验。
3.我导师从外面回来时带回来的一抗，估计不太到一年，就没有什么效果了，你的一抗是不是也不太好了？当然也可能是跟你膜上的目的蛋白丰度不太大有关，你用丽春红染液染染看看，在相应位置是否用条带。封口机很便宜的也不用太好，这样关键是节省抗体，以前没有的时候我们用个小方盒，包上保鲜膜，4℃过夜，那样抗体蒸发很厉害，你可以在保鲜膜上压下一个小锥形，让蒸发的液体都集中在锥形顶端，方便回收。
4.加入发光试剂后可适当等等，关上灯看看，要是看不到很可能就没有蛋白，要是全膜都发亮要不就是你的一抗特异性不强，要不就是封闭有问题，曝光时间你自己可以摸索一下，膜是可以重复曝光的，如果荧光消失了，可用TBST清洗一下，再加上发光试剂就可以再用了。
我也刚开始做，有些不一定对，希望哪点可以帮到你
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5楼2011-10-23 11:13:57
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