| 查看: 2005 | 回复: 4 | |||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | |||
xiajing_acm新虫 (小有名气)
|
[求助]
关于Western的许多不明白与不清楚的地方
|
||
|
给位大侠： 你们好！ 我刚开始做western，试验中碰到许多问题，劳驾帮我一下，非常感谢！ 我做的蛋白包括p21（21KD）、CyclinD1（37KD）、HDAC3（49KD）、HDAC4（119KD）及内参beta-actin（42KD）。 1、关于加样及电泳：因为我做的大部分是核蛋白，所以提核蛋白做的。可核蛋白浓度每次提的都很低，最小的只有0.65ug/ul左右，1mm的梳子(最大上样量44ul)最多大约只能加20ug，不知道上样量是不是不够呢？上样的时候总有样品溢出污染另一孔，对于上大体积的样大家有好的加样方法吗？p21较小，电泳的时候跑到底20KD Marker都看不清楚，该如何判断是否已经跑开了呢？ 2、关于转膜：我用的湿转0.45umPVDF膜，第一次用250mA转2h，发现预染Marker已经转到滤纸上了，可曝光内参条带还比较清晰，p21没有条带；第二次用250mA转1h，p21隐约有条带，而250mA转2h发现CyclinD1与HDAC3却没有条带。请教下大家：预染Marker转到滤纸上就证明蛋白转过了吗？我到底该如何选择p21（21KD）、CyclinD1（37KD）、HDAC3（49KD）、HDAC4（119KD）及内参beta-actin（42KD）的转膜条件呢？ 3、一抗孵育：这里要说一下，我的抗体p21与CyclinD1是Santa的，p21已经过了1年零8个月的样子，CyclinD1快到一年；HDAC3与HDAC4是CST的，超过送货期1年8个月了，不知道做的效果不好是不是跟抗体过期有关啊？可是内参时间也过了很久能做出来啊，这是怎么回事呢？是ProteinTech的！怎样检验一抗是否过期及效价呢？还有，没有热熔机该如何孵育一抗呢？室温还是4度过夜？ 4、发光及显影：发光液加到膜上一般发光多久曝光呢？尤其是看不到荧光的情况下？是不是等一段时间啊？我用的是Pierce的SuperSignal Substrate！有时候加发光液后整个膜发亮，但不见荧光条带是怎么回事呢？还有，曝光的时间一般多少比较好啊？ 问题太多，希望大家帮帮忙啊！谢谢啦！ |
回复此楼» 收录本帖的淘帖专辑推荐
 蛋白质生物学实验经验 |
» 猜你喜欢
筑牢营养安全线：以精准检测，护健康基石
已经有0人回复
-
推荐一些20种氨基酸检测的实际应用案例
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有231人回复
-
不合理蛙科研实验中的趣事：实验器材的 “乌龙”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验中的趣事：和实验材料的 “斗智斗勇”
已经有0人回复
-
蛋白质检测：精准分析，解锁生物分子的密码
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之小鼠实验：严谨设计，解析生命机制的重要载体
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之重金属检测：精准筛查，守护健康与环境的防线
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“蛙测重金属我背锅三千”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“鼠逃三次我发三篇SCI”
已经有0人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 初入这一行的小菜鸟继续您的帮助，关于凝胶柱和PH试纸的不清楚的地方
已经有4人回复
- 拿了个offer，不过有些地方不明白，关于德国DAAD的
已经有8人回复
- 填写香港的FORM ID990a 有几个地方不明白
已经有4人回复
- 求助：petro mod软件中几点不明白的地方，请求帮助
已经有9人回复
- ORIGIN画的四合一图，放在WORD上有点看不清楚，能拉对角放大吗？谢谢！
已经有17人回复
- 【求助】关于guess=alter的一个不明白的地方。
已经有5人回复
- western blot 半干转膜后，发现条带个别缺失，不知道什么原因，请教各位
已经有1人回复