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山水506

铜虫 (初入文坛)

[求助] western blot 出不来结果!!!

各位达人,我刚开始做western,不过也做过好多次了,每一次要么是什么都没有,要么是有若隐若现的条带,结果总是不好。请问是怎么回事啊?
PS:用考马斯亮蓝染色,发现胶上基本没有蛋白了,可在曝光后用丽春红染膜后没有发现蛋白条带,但在网上查,说有的没染出来也能做出来啊!
谢谢各位了~~
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xiaoqi5992

银虫 (正式写手)

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除了上面几位说的你也可以考虑考虑上样量的问题,加大上样量试试。
5楼2012-11-05 09:27:29
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wenzonglu

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
考马斯亮蓝染不出条带,说明凝胶上没有蛋白,更不说转膜啦。先确定目的蛋白在凝胶上,可加标准蛋白来确定,加大上样量。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]

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2楼2012-11-03 14:23:16
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wsgcc

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
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yqbter: 金币+1, 鼓励发高质量帖 2012-11-03 17:19:29
山水506: 金币+10, ★★★很有帮助, 谢谢了 2012-11-07 21:21:42
Western是要比考染敏感,肉眼看不到的条带也wetstern可出条带。我觉得楼主的问题可以进行以下尝试:
1.可以同时跑两块一样的胶,一块直接考染,一块转膜后考染,进行一下对比;
2.买个预染蛋白Marker一起跑、转,这样转没转过去,一目了然,国产的预染Marker也不贵;
3.胶上蛋白没了,丽春红膜上没染出来,是不是转过了,直接到膜底下的滤纸上去了,用PVDF膜要好些。
以上仅供参考,祝实验顺利,呵呵。
3楼2012-11-03 14:48:02
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遥控器68

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
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yqbter: 金币+1, 鼓励发帖! 2012-11-03 17:19:38
山水506: 金币+2, 有帮助 2012-11-07 21:22:08
在一块胶上点两遍样,一半考染一半转膜。
转的时候注意时间,可以换换显色方法。
抗体质量怎么样,工作用比例是多少刚做时候试个比较好的浓度出来。
4楼2012-11-03 15:03:21
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jl860822

金虫 (正式写手)


【答案】应助回帖

★ ★
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看天: 金币+2, 鼓励交流 2012-11-09 10:13:28
看你的蛋白表达量吧,有些蛋白确实是比较难做,你的一抗是什么牌子的?还有,蛋白是多大?我感觉Western的结果分析要远比做Western本身复杂,你可以像上述的几楼上建议的那样,我的建议是你可以买个发光Marker,这个能检测你的转膜效率,很好使的,另外增加上样量也是必需的

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6楼2012-11-05 12:10:58
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山水506

铜虫 (初入文坛)

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引用回帖:
2楼: Originally posted by wenzonglu at 2012-11-03 14:23:16
考马斯亮蓝染不出条带,说明凝胶上没有蛋白,更不说转膜啦。先确定目的蛋白在凝胶上,可加标准蛋白来确定,加大上样量。

我是转好膜后才染的胶,所以理应是转到膜上了的。可就是做出的条带很淡很淡或者就没有。今天刚曝的结果还是很淡。。。
7楼2012-11-07 21:20:56
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山水506

铜虫 (初入文坛)

送鲜花一朵
引用回帖:
6楼: Originally posted by jl860822 at 2012-11-05 12:10:58
看你的蛋白表达量吧,有些蛋白确实是比较难做,你的一抗是什么牌子的?还有,蛋白是多大?我感觉Western的结果分析要远比做Western本身复杂,你可以像上述的几楼上建议的那样,我的建议是你可以买个发光Marker,这个 ...

抗体应该都没有问题的,蛋白30~40Kb。250mA转2个小时,师姐能做出来,我就不行。最主要的是我的内参有时候都没有或者很淡。。。急求助啊~~
8楼2012-11-07 21:24:51
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jl860822

金虫 (正式写手)


【答案】应助回帖

内参如果有问题的话,那估计就是你提取的蛋白可能有问题了,有降解,应该是,正常讲的话,内参蛋白是很亮的条带

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9楼2012-11-08 08:36:35
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tantingting

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

蛋白浓度是多少?上了多少ug?

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10楼2012-11-08 09:45:41
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