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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 夏天Western Blot 曝光总是白片
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杀生丸殿下_q

银虫 (初入文坛)

[求助] 夏天Western Blot 曝光总是白片

请教各位WB高手  有没有遇到过夏天（外界气温较高）做WB  胶片曝光曝不出来的情况？
我们实验室长期都在做WB 在天气冷的时候做WB一点问题没有 可是到了天热 WB总是大把大把白片情况出现  以下是我们采取的对策
1显影定影是刚换的
2 一抗为冰箱4度孵育过夜（12h）
3 二抗则是4摄氏度冰箱孵育 （怕牛奶HRP的二抗发酵坏掉  一般二抗孵育小于8h ）
3曝光前 还会把PBST洗好的膜（10min/次 共4次）放在冰箱4度1h左右  （尝试是不是因为膜的温度过高而影响ECL液的酶促反应）
4PS.  做胶的技术应该不会出现问题  跑胶正常 嗅酚蓝刚漂停止跑胶（marker清晰可见  水平  ） 转膜没有4度的条件 就用的预冷的trans buffer转膜  转膜后的PVDF膜上marker也清晰可见  膜与胶之间没有气泡

感觉该做的都做了 该小心的都小心了 可是曝光的时候总是大片白片出现 运气好的话可能会出现某一张膜有条带   其他膜白片 或者是荧光一下子就淬灭的情况

请教各位高手 不胜感激

[ Last edited by 杀生丸殿下_q on 2013-7-5 at 22:38 ]
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1楼2013-07-05 22:33:21
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
137167741: 金币+3, 小木虫交流，共同进步~~ 2013-07-06 08:41:51
杀生丸殿下_q: 金币+4, ★有帮助 2013-07-06 18:45:56
你是说实验室温度非常高吗？一般的western孵育在室温下进行就可以了，4°C下抗原抗原结合以及酶促反应都会变慢。一抗一般4°C过夜没有什么，因为孵育时间比较长。二抗都是做室温1-2h就可以了，放在4°C做适当延长时间也是可以的。至于为什么你的western失败，我想可能有其它原因。你的ECL是否过期失效了？
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2楼2013-07-06 00:56:19
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1759005335

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
137167741: 金币+1, 小木虫交流，共同进步~~ 2013-07-06 14:00:58
杀生丸殿下_q: 金币+4, ★有帮助 2013-07-06 18:46:04
你说温度热，你那边大概多少度，我这边30多度在外面1各半小时，没有什么问题，还有在试验过程中，可以染下膜看看转移效果，做的时候加一个内参看看，不过我想这些应该不是做不出来的原因，你看你的一些东西有没有不好用，如楼上的发光液等一些试剂
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just do it
3楼2013-07-06 10:37:14
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普通回帖

杀生丸殿下_q

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-07-06 00:56:19
你是说实验室温度非常高吗？一般的western孵育在室温下进行就可以了，4°C下抗原抗原结合以及酶促反应都会变慢。一抗一般4°C过夜没有什么，因为孵育时间比较长。二抗都是做室温1-2h就可以了，放在4°C做适当延长时 ...

实验室一直开着空调 就是门总开 外界温度应该不会特别高 25-30度左右吧   你们说的东西坏 的确有可能 可是已经想不出来哪里有东西坏了 因为胶 缓冲液  发光液 都是重新配置的了
但是 ECL确实是还是会让人心存疑虑   因为有同学发现把膜倾入ECL是有条带的 但是一拿出来 还没来及拿胶片 荧光瞬间淬灭 也有曝光比如12个样品  特别悲催的只能出现10个孔的条带 因为其中有那么1个 2个立刻淬灭掉了的情况  可是用了BD试用装的ECL似乎这个问题也不能够缓解  
总之 曝光这个环节特别怪异  要么全部白片 要么瞬间淬灭 实在是搞不明白究竟发生了什么
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4楼2013-07-06 16:08:08
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杀生丸殿下_q

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 1759005335 at 2013-07-06 10:37:14
你说温度热，你那边大概多少度，我这边30多度在外面1各半小时，没有什么问题，还有在试验过程中，可以染下膜看看转移效果，做的时候加一个内参看看，不过我想这些应该不是做不出来的原因，你看你的一些东西有没有不 ...

我们的膜是反复利用的 就是曝光一次之后的膜还要洗干净再孵其他一抗 直到把这个膜用尽  所以不能放在室温孵育 都在4度 所以适当的延长时间 东西不好用 的确有可能 而且只是夏天不好用  请教WB 哪一个环节对温度要求特别高呢?
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5楼2013-07-06 16:09:42
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tangmincui

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
都改四度不太好吧，改条件一个一个改，都改了得话，你也不知道哪个是真正的原因了。

洗膜常温就OK吧，要不你把摇床调到20多度，这样是不是会好些。  

还有膜反复利用好吗？做一次好几天，别再膜上节省了，浪费时间浪费感情的，建议不要反复利用膜了。
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6楼2013-07-06 22:21:38
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zhouking8758

木虫 (正式写手)
我觉得是你的显色液的问题。
注意其中双氧水是否已经分解
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7楼2013-07-06 23:23:11
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by 杀生丸殿下_q at 2013-07-06 16:08:08
实验室一直开着空调 就是门总开 外界温度应该不会特别高 25-30度左右吧   你们说的东西坏 的确有可能 可是已经想不出来哪里有东西坏了 因为胶 缓冲液  发光液 都是重新配置的了
但是 ECL确实是还是会让人心存疑虑 ...

25-30°C不是很高，牛奶啊、蛋白啊不会那么容易坏掉的。ECL的确稳定性不是很好，信号会随时间减弱。一般商品化的ECL应该在浸泡膜后一两个个小时之内都可以的。还有就是两个溶液不要太早混起来，暴光前再混，最好避光。不知道你用的产品是不是质量不行。如果是这种情况，你可以试试在暗室里泡膜，然后立即暴光。实在不行，还是换一家公司的ECL吧。
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8楼2013-07-07 01:15:51
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实验完成时

金虫 (小有名气)
问题解决么？我们实验室也有类似的问题，也不知道怎么办
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9楼2013-07-10 17:49:13
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yu745159

金虫 (小有名气)
我们之前发光药水浸泡3min，天太热会出白片，但如果是1min的话，就不会有白片。发光药水一定要A+B后立即把膜放入。
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10楼2013-09-22 17:13:02
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