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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » Western Blot出现问题
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jl860822

金虫 (正式写手)

[求助] Western Blot出现问题 已有1人参与

最近Western blot做不出结果，希望大家多多指教
目的蛋白大小20kD左右，跑SDS可以看到，转膜后也可以看到，但是ECL显色后没有条带，只有白的亮的一片，而且也不清楚这些亮的一片到底是化学发光还是其他什么东西，各位高手有没有遇到这种情况，希望能给些好的建议
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jl860822

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1楼 2012-07-04 21:39:41
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回帖置顶 ( 共有1个 )

jacky1985310

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, MolEPI+1, 鼓励交流经验 2012-07-06 13:48:17
jl860822: 金币+2, ★★★很有帮助 2012-07-09 22:12:22
不知道你所谓的转膜后也可以看到是什么意思？是通过CBB外其他染色看的吗？
首先确认一下自己的ECL化学发光操作步骤是否正确。ECL混合后，膜孵育的时间是多久？因为ECL发光强度是一个峰值曲线，过早或过完曝光都不合适。曝光时间可以控制在5-30min之间（排除膜孵育的5min）。
然后请问你是否将光圈全开，曝光时间是多久？
楼主应该是positive成像的吧？即背景是黑色，目的条带为白色。
如果是这样的话，全亮的区域可能有目标条带，可能是由于浓度过高或者曝光时间过久造成的。我就遇到过浓度过高的情况，一块白，而且ECL之后条带部位都有明显的棕黄烧焦的颜色。
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2楼2012-07-06 12:17:04
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jl860822

金虫 (正式写手)
送鲜花一朵
您也出现过一片白的情况？您方便留个QQ吗？我加你
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3楼2012-07-09 10:57:10
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tiger234

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

没用过这个牌子的二抗。1:3000肯定算高的了，而且你洗的时间太短。如果我摸索条件，肯定起始二抗浓度1:10000，洗至少3次，每次10分钟，然后慢慢曝光。
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12楼2012-07-11 23:41:34
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普通回帖

jl860822

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by jacky1985310 at 2012-07-06 12:17:04
不知道你所谓的转膜后也可以看到是什么意思？是通过CBB外其他染色看的吗？
首先确认一下自己的ECL化学发光操作步骤是否正确。ECL混合后，膜孵育的时间是多久？因为ECL发光强度是一个峰值曲线，过早或过完曝光都不合 ...

我用的是可视Marker，转膜后可以清楚地看到，ECL混合后，我一般避光孵育3min左右，然后曝光3min，我用的是positive成像，但我觉得我的图片中的一片白不像是目的蛋白发出的荧光
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4楼2012-07-09 11:03:37
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zhangchch

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
jl860822: 金币+1, ★有帮助 2012-07-09 22:12:40
我做WB曝光也出现过一片白的情况，但我是用X胶片曝光，第一次发光液加完没弃掉，曝光都是一边白，后面一次加发光液后弃掉，曝光时就好多了。
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科比
5楼2012-07-09 17:15:44
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nieyaru

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
jl860822: 金币+1, ★有帮助 2012-07-09 22:12:47
是不是淬灭了 我也出现过这种现象 老板说是可能淬灭了
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6楼2012-07-09 19:50:23
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jl860822

金虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by zhangchch at 2012-07-09 17:15:44
我做WB曝光也出现过一片白的情况，但我是用X胶片曝光，第一次发光液加完没弃掉，曝光都是一边白，后面一次加发光液后弃掉，曝光时就好多了。

应该不是这个原因，因为我没有进行胶片显影，直接扫胶，但是还是谢谢你
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7楼2012-07-09 21:55:01
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jl860822

金虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by nieyaru at 2012-07-09 19:50:23
是不是淬灭了 我也出现过这种现象 老板说是可能淬灭了

淬灭是指荧光强度降低，但是我现在不是荧光强度的降低，而是整个胶片全是白的亮的一片，现在都不好分析到底是怎么回事
仍然谢谢你
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8楼2012-07-09 21:56:57
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tiger234

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

如果像你说的信号过强，那你用的二抗浓度多大，洗了多久？ 包括一抗浓度选用合适吗？
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9楼2012-07-10 00:53:21
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jl860822

金虫 (正式写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by tiger234 at 2012-07-10 00:53:21
如果像你说的信号过强，那你用的二抗浓度多大，洗了多久？ 包括一抗浓度选用合适吗？

我不确定胶片上一片白的亮的到底是什么，貌似也不是荧光，我的二抗是用的华安的，稀释倍数按照说明书来的（1:3000），洗了2次，每次5min，一抗是用的国产的，稀释倍数也是按照说明书给的范围来的（1:1500）
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10楼2012-07-10 08:41:01
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