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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » Western Blot出现问题
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jacky1985310

新虫 (小有名气)
★ ★ ★
小丹木木: 金币+3, 鼓励交流 2012-07-12 13:48:47
引用回帖:
4楼: Originally posted by jl860822 at 2012-07-09 11:03:37
我用的是可视Marker，转膜后可以清楚地看到，ECL混合后，我一般避光孵育3min左右，然后曝光3min，我用的是positive成像，但我觉得我的图片中的一片白不像是目的蛋白发出的荧光...

每次做都会有一片白吗？每次出现的位置是否一致？
如果不是蛋白的荧光那就不好说了。成像仪，夹膜的透明薄膜是否有问题?
排除了器具问题，就是试剂和操作了。
抗体效价如何？浓度也不能完全按照说明书来的，因为融合蛋白不同，抗体表现也存在差异。实在不行换个好点的抗体试试。
话说回来你的CBB染色可以看到目的条带吗？
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11楼2012-07-11 20:04:33
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tiger234

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

没用过这个牌子的二抗。1:3000肯定算高的了，而且你洗的时间太短。如果我摸索条件，肯定起始二抗浓度1:10000，洗至少3次，每次10分钟，然后慢慢曝光。
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12楼2012-07-11 23:41:34
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jl860822

金虫 (正式写手)
引用回帖:
11楼: Originally posted by jacky1985310 at 2012-07-11 20:04:33
每次做都会有一片白吗？每次出现的位置是否一致？
如果不是蛋白的荧光那就不好说了。成像仪，夹膜的透明薄膜是否有问题?
排除了器具问题，就是试剂和操作了。
抗体效价如何？浓度也不能完全按照说明书来的，因为 ...

我准备这次增加一下上样量试试，因为这次考染色没看到我的蛋白或者说量很小，这次再试试，如果不可以的话，继续向各位请教
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13楼2012-07-12 08:59:22
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jl860822

金虫 (正式写手)
引用回帖:
12楼: Originally posted by tiger234 at 2012-07-11 23:41:34
没用过这个牌子的二抗。1:3000肯定算高的了，而且你洗的时间太短。如果我摸索条件，肯定起始二抗浓度1:10000，洗至少3次，每次10分钟，然后慢慢曝光。

1:10000？二抗浓度太低了吧！？我现在都是用1:2000左右
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14楼2012-07-12 09:00:58
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jacky1985310

新虫 (小有名气)
引用回帖:
14楼: Originally posted by jl860822 at 2012-07-12 09:00:58
1:10000？二抗浓度太低了吧！？我现在都是用1:2000左右...

我用的也是1:10000没问题的
不过公司不一样。
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15楼2012-07-12 17:47:57
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jl860822

金虫 (正式写手)
Western做出来了，谢谢各位的帮忙！
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16楼2012-07-13 15:12:58
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jl860822

金虫 (正式写手)
本人已经做出来了，谢谢大家的回帖，真心感谢
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17楼2012-07-15 11:51:46
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fxh1229

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

楼主最后是怎么解决问题的？我最近也遇到与你相同的问题，想请教一下。
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任何东西只要够深都是一把刀
18楼2012-10-30 22:46:07
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jl860822

金虫 (正式写手)
引用回帖:
18楼: Originally posted by fxh1229 at 2012-10-30 22:46:07
楼主最后是怎么解决问题的？我最近也遇到与你相同的问题，想请教一下。

我的是一抗的问题，浓度太低了，国产的一抗我，我现在调到1:100了
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19楼2012-10-31 08:49:55
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gao809

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

可能是信号过强，减少上样量，一抗及二抗的量。
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20楼2014-09-01 19:12:20
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