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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » Western Blot出现问题
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jl860822

金虫 (正式写手)

[求助] Western Blot出现问题 已有1人参与

最近Western blot做不出结果，希望大家多多指教
目的蛋白大小20kD左右，跑SDS可以看到，转膜后也可以看到，但是ECL显色后没有条带，只有白的亮的一片，而且也不清楚这些亮的一片到底是化学发光还是其他什么东西，各位高手有没有遇到这种情况，希望能给些好的建议
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jl860822

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1楼 2012-07-04 21:39:41
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fxh1229

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

楼主最后是怎么解决问题的？我最近也遇到与你相同的问题，想请教一下。
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任何东西只要够深都是一把刀
18楼2012-10-30 22:46:07
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jacky1985310

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, MolEPI+1, 鼓励交流经验 2012-07-06 13:48:17
jl860822: 金币+2, ★★★很有帮助 2012-07-09 22:12:22
不知道你所谓的转膜后也可以看到是什么意思？是通过CBB外其他染色看的吗？
首先确认一下自己的ECL化学发光操作步骤是否正确。ECL混合后，膜孵育的时间是多久？因为ECL发光强度是一个峰值曲线，过早或过完曝光都不合适。曝光时间可以控制在5-30min之间（排除膜孵育的5min）。
然后请问你是否将光圈全开，曝光时间是多久？
楼主应该是positive成像的吧？即背景是黑色，目的条带为白色。
如果是这样的话，全亮的区域可能有目标条带，可能是由于浓度过高或者曝光时间过久造成的。我就遇到过浓度过高的情况，一块白，而且ECL之后条带部位都有明显的棕黄烧焦的颜色。
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2楼2012-07-06 12:17:04
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jl860822

金虫 (正式写手)
送鲜花一朵
您也出现过一片白的情况？您方便留个QQ吗？我加你
赞一下(1人) 回复此楼
3楼2012-07-09 10:57:10
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jl860822

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by jacky1985310 at 2012-07-06 12:17:04
不知道你所谓的转膜后也可以看到是什么意思？是通过CBB外其他染色看的吗？
首先确认一下自己的ECL化学发光操作步骤是否正确。ECL混合后，膜孵育的时间是多久？因为ECL发光强度是一个峰值曲线，过早或过完曝光都不合 ...

我用的是可视Marker，转膜后可以清楚地看到，ECL混合后，我一般避光孵育3min左右，然后曝光3min，我用的是positive成像，但我觉得我的图片中的一片白不像是目的蛋白发出的荧光
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4楼2012-07-09 11:03:37
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