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fyh12788

银虫 (初入文坛)

[求助] western blot 条带

western blot条带连成一线,没有带型。蛋白上样量不大,配胶是实验室公用的,pH没弄错,上完样马上就跑了。刚开始跑电泳的时候能分清泳道,后来就连一块了,没有带型。
一两周都是这样,谁能告诉我是为什么,谢谢啊。

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henryxue

木虫 (小有名气)

★ ★
wizardfan: 金币+2, 谢谢分享经验,以后如果是应助的话,请选择应助回帖,不然楼主没法给奖励 2012-12-09 07:15:01
你说的是最左边粗粗的一整条吗?这个是不是你胶溴酚蓝的地方?是不是你膜的最边上?
从你中间隐约的条带来看,似乎分离胶与浓缩胶界面也不像有问题,有时候会因为界面凝得不好条带会漏到相邻的地方。
2楼2012-12-08 20:19:54
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
从你marker右边的几个泳道看,问题似乎不是很大。可以把胶染一下看。有时候目的蛋白浓度很高,即使总蛋白上样量不大也会出现这种情况。
3楼2012-12-09 02:36:19
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fyh12788

银虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by henryxue at 2012-12-08 20:19:54
你说的是最左边粗粗的一整条吗?这个是不是你胶溴酚蓝的地方?是不是你膜的最边上?
从你中间隐约的条带来看,似乎分离胶与浓缩胶界面也不像有问题,有时候会因为界面凝得不好条带会漏到相邻的地方。

恩,最左边粗条带,10多KD,在靠边的地方。它上侧的带型就不正常。
不知道究竟是什么问题
4楼2012-12-09 10:23:02
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fyh12788

银虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-12-09 02:36:19
从你marker右边的几个泳道看,问题似乎不是很大。可以把胶染一下看。有时候目的蛋白浓度很高,即使总蛋白上样量不大也会出现这种情况。

染了下胶,胶上条带也是,上部分胶能分清泳道。下面的条带也连在一起。蛋白浓度高的话,曝光量不应该也大吗
5楼2012-12-09 10:25:56
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖


wizardfan: 金币+1, 谢谢参与 2012-12-10 08:16:02
引用回帖:
5楼: Originally posted by fyh12788 at 2012-12-09 10:25:56
染了下胶,胶上条带也是,上部分胶能分清泳道。下面的条带也连在一起。蛋白浓度高的话,曝光量不应该也大吗...

Western信号的强弱要看抗体的效价,与单个蛋白的绝对量没有直接关系。如果小分子量蛋白样品连在一起而胶的上部分分开,可能是电泳停下来后扩散了,因为小分子量蛋白扩散比较快。停电泳前把转膜的东西都准备好,电泳结束后立即转膜。
6楼2012-12-09 12:40:47
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henryxue

木虫 (小有名气)

跑了多大浓度的胶?是不是下面没有分开?
7楼2012-12-09 20:29:54
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fyh12788

银虫 (初入文坛)

引用回帖:
7楼: Originally posted by henryxue at 2012-12-09 20:29:54
跑了多大浓度的胶?是不是下面没有分开?

10%的胶,没有分开
8楼2012-12-10 09:00:02
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fyh12788

银虫 (初入文坛)

引用回帖:
6楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-12-09 12:40:47
Western信号的强弱要看抗体的效价,与单个蛋白的绝对量没有直接关系。如果小分子量蛋白样品连在一起而胶的上部分分开,可能是电泳停下来后扩散了,因为小分子量蛋白扩散比较快。停电泳前把转膜的东西都准备好,电泳 ...

可是染胶以后,中间部分的条带就已经连在一块了
9楼2012-12-10 09:00:46
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juanzi7229

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
是不是胶没有做好,漏了啊?还有就是可能抗体效价太高,曝光的时间短点呢?然后快速显影,这种现象我也遇到过,大概就是因为上述的情况。
10楼2012-12-10 10:16:40
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