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fyh12788

银虫 (初入文坛)

[求助] western blot 条带

western blot条带连成一线，没有带型。蛋白上样量不大，配胶是实验室公用的，pH没弄错，上完样马上就跑了。刚开始跑电泳的时候能分清泳道，后来就连一块了，没有带型。
一两周都是这样，谁能告诉我是为什么，谢谢啊。

1.jpg
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1楼 2012-12-08 14:36:25
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henryxue

木虫 (小有名气)
★ ★
wizardfan: 金币+2, 谢谢分享经验，以后如果是应助的话，请选择应助回帖，不然楼主没法给奖励 2012-12-09 07:15:01
你说的是最左边粗粗的一整条吗？这个是不是你胶溴酚蓝的地方？是不是你膜的最边上？
从你中间隐约的条带来看，似乎分离胶与浓缩胶界面也不像有问题，有时候会因为界面凝得不好条带会漏到相邻的地方。
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2楼2012-12-08 20:19:54
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
从你marker右边的几个泳道看，问题似乎不是很大。可以把胶染一下看。有时候目的蛋白浓度很高，即使总蛋白上样量不大也会出现这种情况。
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3楼2012-12-09 02:36:19
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fyh12788

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by henryxue at 2012-12-08 20:19:54
你说的是最左边粗粗的一整条吗？这个是不是你胶溴酚蓝的地方？是不是你膜的最边上？
从你中间隐约的条带来看，似乎分离胶与浓缩胶界面也不像有问题，有时候会因为界面凝得不好条带会漏到相邻的地方。

恩，最左边粗条带，10多KD，在靠边的地方。它上侧的带型就不正常。
不知道究竟是什么问题
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4楼2012-12-09 10:23:02
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fyh12788

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-12-09 02:36:19
从你marker右边的几个泳道看，问题似乎不是很大。可以把胶染一下看。有时候目的蛋白浓度很高，即使总蛋白上样量不大也会出现这种情况。

染了下胶，胶上条带也是，上部分胶能分清泳道。下面的条带也连在一起。蛋白浓度高的话，曝光量不应该也大吗
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5楼2012-12-09 10:25:56
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
wizardfan: 金币+1, 谢谢参与 2012-12-10 08:16:02
引用回帖:
5楼: Originally posted by fyh12788 at 2012-12-09 10:25:56
染了下胶，胶上条带也是，上部分胶能分清泳道。下面的条带也连在一起。蛋白浓度高的话，曝光量不应该也大吗...

Western信号的强弱要看抗体的效价，与单个蛋白的绝对量没有直接关系。如果小分子量蛋白样品连在一起而胶的上部分分开，可能是电泳停下来后扩散了，因为小分子量蛋白扩散比较快。停电泳前把转膜的东西都准备好，电泳结束后立即转膜。
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6楼2012-12-09 12:40:47
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henryxue

木虫 (小有名气)
跑了多大浓度的胶？是不是下面没有分开？
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7楼2012-12-09 20:29:54
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fyh12788

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by henryxue at 2012-12-09 20:29:54
跑了多大浓度的胶？是不是下面没有分开？

10%的胶，没有分开
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8楼2012-12-10 09:00:02
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fyh12788

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-12-09 12:40:47
Western信号的强弱要看抗体的效价，与单个蛋白的绝对量没有直接关系。如果小分子量蛋白样品连在一起而胶的上部分分开，可能是电泳停下来后扩散了，因为小分子量蛋白扩散比较快。停电泳前把转膜的东西都准备好，电泳 ...

可是染胶以后，中间部分的条带就已经连在一块了
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9楼2012-12-10 09:00:46
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juanzi7229

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
是不是胶没有做好，漏了啊？还有就是可能抗体效价太高，曝光的时间短点呢？然后快速显影，这种现象我也遇到过，大概就是因为上述的情况。
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10楼2012-12-10 10:16:40
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