应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 有没有人用Western blot在做17kDa蛋白质,求经验！！！
231/1返回列表
查看: 5366  |  回复: 22
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

神经再生

铁杆木虫 (著名写手)

[交流] 有没有人用Western blot在做17kDa蛋白质,求经验！！！

有没有人用Western blot在做17kDa左右的蛋白质分子
现在知道分离胶需要使用15%，转膜之后丽春红染色只能看到大分子条带，小分子的看不到。
求解：
电泳时的电压，时间应该用多少的？？？
转膜的条件又如何，比如电压、时间？？？注：本实验室使用湿转还有没有其他的注意事情，比如蛋白提取过程的问题，有人说小分子的蛋白比较容易降解。。。

[ Last edited by 神经再生 on 2012-6-4 at 09:50 ]
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

蛋白质生物学实验经验 蛋白相关

» 猜你喜欢

» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:

» 抢金币啦！回帖就可以得到:

查看全部散金贴
1楼 2012-05-30 09:34:23
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

小小神经细胞

铁虫 (小有名气)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
神经再生: 金币+1 2012-05-31 09:36:39
17KD的分子量的蛋白不算太小，和b-actin的条件差不多就可以，没有那么脆弱，只要你保证转膜转上了，抗体没问题，就可以做出来，我做过18KD的
赞一下(1人) 回复此楼
2楼2012-05-30 14:11:57
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

神经再生

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
11楼: Originally posted by 小小神经细胞 at 2012-05-31 21:39:45
100v 2h有点长，但是要看你用半干转还是湿转，我用的是半干转，300mA 30min-1h都可以，0.22uM的膜，再跑一个marker，应该没什么问题...

用的湿转  小分子mark虽然不是很清楚了  但是还是能看得到 就是比较浅（与大分子相比）  有没有什么问题
赞一下(1人) 回复此楼
14楼2012-06-01 23:00:41
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

小小神经细胞

铁虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
14楼: Originally posted by 神经再生 at 2012-06-01 23:00:41
用的湿转  小分子mark虽然不是很清楚了  但是还是能看得到 就是比较浅（与大分子相比）  有没有什么问题...

一般都是可以看得清楚的，湿转的话，不超过200mA，时间段一些都可以，没关系，只要你保证你的蛋白提的没问题，这些都不是大问题
赞一下(1人) 回复此楼
20楼2012-06-02 13:23:50
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

睿睿830716

新虫 (初入文坛)
★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
yqbter: 金币+2, 鼓励新虫发帖应助！ 2012-05-31 08:21:15
神经再生: 金币+1, 恒压 80mA？？ 2012-05-31 09:37:06
你可以使用预染MARKER也叫彩虹MARKER，跑完蛋白电泳之后不用染色可以清晰看到条带，在做Western blot时会很清晰，MARKER 都转到膜上你的目的条带也一定转到膜上了，一般恒压80mA，一个半小时就差不多了，17KD的分子量的蛋白肯定能转过去，也不需要丽春红染色，很方便
赞一下 回复此楼
3楼2012-05-30 20:05:12
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

睿睿830716

新虫 (初入文坛)
你可以使用预染MARKER也叫彩虹MARKER，跑完蛋白电泳之后不用染色可以清晰看到条带，在做Western blot时会很清晰，MARKER 都转到膜上你的目的条带也一定转到膜上了，一般恒流80mA，一个半小时就差不多了，17KD的分子量的蛋白肯定能转过去，也不需要丽春红染色，很方便
赞一下 回复此楼
4楼2012-05-30 20:06:53
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

jiangda302

银虫 (初入文坛)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
神经再生: 金币+1 2012-05-31 09:37:20
加个GENESTAR的170KD预染marker看着条带差不多就停电泳，那个东西不贵
赞一下 回复此楼
5楼2012-05-30 21:38:22
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zrtpaopao

金虫 (小有名气)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
神经再生: 金币+1 2012-05-31 16:04:09
“只能看到大分子量条带，小分子的看不到”应该是转膜时间过长，小分子的转过了吧。小分子量需要的转膜时间短一些，大分子量的比较难转需要时间长一些。
赞一下 回复此楼
6楼2012-05-31 11:00:07
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

神经再生

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by zrtpaopao at 2012-05-31 11:00:07
“只能看到大分子量条带，小分子的看不到”应该是转膜时间过长，小分子的转过了吧。小分子量需要的转膜时间短一些，大分子量的比较难转需要时间长一些。

我用的100v 2h，是不是过了？应该怎么转？谢谢
赞一下 回复此楼
7楼2012-05-31 16:04:46
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

神经再生

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 小小神经细胞 at 2012-05-30 14:11:57
17KD的分子量的蛋白不算太小，和b-actin的条件差不多就可以，没有那么脆弱，只要你保证转膜转上了，抗体没问题，就可以做出来，我做过18KD的

你的电泳条件和转膜条件都是什么。。。谢谢!
赞一下 回复此楼
8楼2012-05-31 16:06:19
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

geek23

木虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
7楼: Originally posted by 神经再生 at 2012-05-31 16:04:46
我用的100v 2h，是不是过了？应该怎么转？谢谢...

100v 2小时 长了点吧
我跑survivin 16KD 转膜 100v就转一个小时 同时加冰转 控制电流不要超过0.3A  如果其他大分子量的蛋白在 很有可能是穿膜了 小分子的跑过去了
赞一下 回复此楼
9楼2012-05-31 17:46:38
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ajinch

金虫 (正式写手)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
神经再生: 金币+1 2012-06-01 22:55:46
我用的300mA，30min。冰水浴。0.22uM的膜。做的14kD，没有问题。
赞一下 回复此楼
10楼2012-05-31 21:15:42
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

小小神经细胞

铁虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
8楼: Originally posted by 神经再生 at 2012-05-31 16:06:19
你的电泳条件和转膜条件都是什么。。。谢谢!...

100v 2h有点长，但是要看你用半干转还是湿转，我用的是半干转，300mA 30min-1h都可以，0.22uM的膜，再跑一个marker，应该没什么问题
赞一下 回复此楼
11楼2012-05-31 21:39:45
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

神经再生

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by geek23 at 2012-05-31 17:46:38
100v 2小时 长了点吧
我跑survivin 16KD 转膜 100v就转一个小时 同时加冰转 控制电流不要超过0.3A  如果其他大分子量的蛋白在 很有可能是穿膜了 小分子的跑过去了...

100v 1h条件下 42kD 的内参 actin  可不可以转过去  因为我想在同一张膜上做两个抗体，  蛋白量比较少
赞一下 回复此楼
12楼2012-06-01 22:57:31
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

神经再生

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
10楼: Originally posted by ajinch at 2012-05-31 21:15:42
我用的300mA，30min。冰水浴。0.22uM的膜。做的14kD，没有问题。

恒流转膜？ 这个条件下不知道42kD的内参actin 可不可以转过去 因为我想在同一张膜上做两个蛋白  ，提的蛋白比较少 谢谢
赞一下 回复此楼
13楼2012-06-01 22:58:44
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

迷情八月

金虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
10楼: Originally posted by ajinch at 2012-05-31 21:15:42
我用的300mA，30min。冰水浴。0.22uM的膜。做的14kD，没有问题。

我的350mA，90min，13KD，0.45um 没问题
赞一下 回复此楼
15楼2012-06-02 00:45:27
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

geek23

木虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
12楼: Originally posted by 神经再生 at 2012-06-01 22:57:31
100v 1h条件下 42kD 的内参 actin  可不可以转过去  因为我想在同一张膜上做两个抗体，  蛋白量比较少...

没有问题的,actin丰度比较高,还有你用的膜孔径是多大的如果是做小分子量的蛋白建议用小孔径的膜.
赞一下 回复此楼
16楼2012-06-02 08:23:00
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zrtpaopao

金虫 (小有名气)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
神经再生: 金币+1, 谢谢！ 2012-06-02 13:15:00
引用回帖:
7楼: Originally posted by 神经再生 at 2012-05-31 16:04:46
我用的100v 2h，是不是过了？应该怎么转？谢谢...

我做的有60KD 150KD左右的经常是100V转2h-2.5h，你可以尝试电压低点80V转2h或者100V转1.5h。这只是我的建议，仅供参考。
赞一下 回复此楼
17楼2012-06-02 09:09:50
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ajinch

金虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
12楼: Originally posted by 神经再生 at 2012-06-01 22:57:31
100v 1h条件下 42kD 的内参 actin  可不可以转过去  因为我想在同一张膜上做两个抗体，  蛋白量比较少...

一般四十kd的我也就用45min.内参我觉得一般问题不大。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
赞一下 回复此楼
18楼2012-06-02 12:53:49
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

神经再生

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
18楼: Originally posted by ajinch at 2012-06-02 12:53:49
一般四十kd的我也就用45min.内参我觉得一般问题不大。
...

湿转法？4度条件下么？ 0.22um的膜？
赞一下 回复此楼
19楼2012-06-02 13:13:21
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

神经再生

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 小小神经细胞 at 2012-05-30 14:11:57
17KD的分子量的蛋白不算太小，和b-actin的条件差不多就可以，没有那么脆弱，只要你保证转膜转上了，抗体没问题，就可以做出来，我做过18KD的

问一下你当时转膜的条件是什么，是不是湿转！
赞一下 回复此楼
21楼2012-08-15 10:18:04
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

小小神经细胞

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
21楼: Originally posted by 神经再生 at 2012-08-15 10:18:04
问一下你当时转膜的条件是什么，是不是湿转！...

半干转
回复此楼
22楼2012-08-15 16:26:28
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

1542758867

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
14楼: Originally posted by 神经再生 at 2012-06-01 23:00:41
用的湿转  小分子mark虽然不是很清楚了  但是还是能看得到 就是比较浅（与大分子相比）  有没有什么问题...

请问您最后是怎么弄的，我的今天也出现这个问题了，我的膜也是0.45的PVDF膜，转膜条件是80V 50min，也是分子量大的条带的mark颜色比较清楚，但是15KD的颜色就很浅了。
赞一下 回复此楼
23楼2016-03-24 10:17:05
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 神经再生 的主题更新
231/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[公派出国] 售SCI一区文章，我:8.O.551.O.5.4,科目全,可伽急 +3 OEbVnUOu01ol 2026-08-22 5/250 2026-08-23 21:35 by 1iADQrSZC7R6
[博后之家] 售SCI一区文章，我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急 +4 h4CP7TrQR8Lg 2026-08-22 4/200 2026-08-23 20:46 by 0p9y1isJp2jM
[基金申请] 让我中一个面上吧！ +12 大萍1987 2026-08-20 15/750 2026-08-23 20:44 by 大萍1987
[找工作] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急 +3 2JOx3r2CYEgw 2026-08-22 5/250 2026-08-23 19:43 by lXgU0RvNTDC9
[博后之家] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急 +3 2JOx3r2CYEgw 2026-08-22 6/300 2026-08-23 19:31 by lXgU0RvNTDC9
[考博] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +4 2JOx3r2CYEgw 2026-08-22 5/250 2026-08-23 19:22 by lXgU0RvNTDC9
[公派出国] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 2JOx3r2CYEgw 2026-08-22 4/200 2026-08-23 19:22 by lXgU0RvNTDC9
[论文投稿] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +3 DpSrDtM079iu 2026-08-22 4/200 2026-08-23 15:30 by KM5EcsNQRBPn
[基金申请] 2026国自然函评费到账 +15 羊腰板 2026-08-21 16/800 2026-08-23 10:45 by process2012
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +3 2JOx3r2CYEgw 2026-08-21 9/450 2026-08-23 10:44 by IXZuIJ2Q7OVy
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急 +3 2JOx3r2CYEgw 2026-08-22 7/350 2026-08-23 03:55 by OEbVnUOu01ol
[论文投稿] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急 +3 QTy3jDtz1uLt 2026-08-21 9/450 2026-08-23 03:04 by OEbVnUOu01ol
[教师之家] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +4 2JOx3r2CYEgw 2026-08-21 4/200 2026-08-22 16:52 by sunzitan
[基金申请] 放榜前的不淡定 40+4 snowwithsea 2026-08-19 14/700 2026-08-21 23:51 by cratir
[基金申请] 今日不放榜？网传国自然预计 8 月 27 日可查结果 +16 医学老男孩 2026-08-20 20/1000 2026-08-21 21:13 by Ldrop2023
[基金申请] 时间戳又变了 +13 wuchongjun 2026-08-20 19/950 2026-08-21 17:21 by 紫杉醇
[基金申请] 感觉是下周放榜了 +7 angus9576 2026-08-17 12/600 2026-08-21 13:38 by weiyin
[基金申请] 估计是周四 +3 archvillain 2026-08-18 3/150 2026-08-21 01:48 by jnhyjjm
[基金申请] 重要消息，中午系统在维护 +11 yuleib84 2026-08-18 12/600 2026-08-20 11:09 by xskun
[基金申请] 朋友圈看到的 +6 wangzilk 2026-08-18 8/400 2026-08-19 10:55 by Haru815
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭