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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 有没有人用Western blot在做17kDa蛋白质,求经验！！！
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神经再生

铁杆木虫 (著名写手)

[交流] 有没有人用Western blot在做17kDa蛋白质,求经验！！！

有没有人用Western blot在做17kDa左右的蛋白质分子
现在知道分离胶需要使用15%，转膜之后丽春红染色只能看到大分子条带，小分子的看不到。
求解：
电泳时的电压，时间应该用多少的？？？
转膜的条件又如何，比如电压、时间？？？注：本实验室使用湿转还有没有其他的注意事情，比如蛋白提取过程的问题，有人说小分子的蛋白比较容易降解。。。

[ Last edited by 神经再生 on 2012-6-4 at 09:50 ]
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1楼 2012-05-30 09:34:23
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小小神经细胞

铁虫 (小有名气)
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神经再生: 金币+1 2012-05-31 09:36:39
17KD的分子量的蛋白不算太小，和b-actin的条件差不多就可以，没有那么脆弱，只要你保证转膜转上了，抗体没问题，就可以做出来，我做过18KD的
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2楼2012-05-30 14:11:57
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神经再生

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
11楼: Originally posted by 小小神经细胞 at 2012-05-31 21:39:45
100v 2h有点长，但是要看你用半干转还是湿转，我用的是半干转，300mA 30min-1h都可以，0.22uM的膜，再跑一个marker，应该没什么问题...

用的湿转  小分子mark虽然不是很清楚了  但是还是能看得到 就是比较浅（与大分子相比）  有没有什么问题
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14楼2012-06-01 23:00:41
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小小神经细胞

铁虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
14楼: Originally posted by 神经再生 at 2012-06-01 23:00:41
用的湿转  小分子mark虽然不是很清楚了  但是还是能看得到 就是比较浅（与大分子相比）  有没有什么问题...

一般都是可以看得清楚的，湿转的话，不超过200mA，时间段一些都可以，没关系，只要你保证你的蛋白提的没问题，这些都不是大问题
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20楼2012-06-02 13:23:50
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睿睿830716

新虫 (初入文坛)
★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
yqbter: 金币+2, 鼓励新虫发帖应助！ 2012-05-31 08:21:15
神经再生: 金币+1, 恒压 80mA？？ 2012-05-31 09:37:06
你可以使用预染MARKER也叫彩虹MARKER，跑完蛋白电泳之后不用染色可以清晰看到条带，在做Western blot时会很清晰，MARKER 都转到膜上你的目的条带也一定转到膜上了，一般恒压80mA，一个半小时就差不多了，17KD的分子量的蛋白肯定能转过去，也不需要丽春红染色，很方便
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3楼2012-05-30 20:05:12
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睿睿830716

新虫 (初入文坛)
你可以使用预染MARKER也叫彩虹MARKER，跑完蛋白电泳之后不用染色可以清晰看到条带，在做Western blot时会很清晰，MARKER 都转到膜上你的目的条带也一定转到膜上了，一般恒流80mA，一个半小时就差不多了，17KD的分子量的蛋白肯定能转过去，也不需要丽春红染色，很方便
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4楼2012-05-30 20:06:53
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jiangda302

银虫 (初入文坛)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
神经再生: 金币+1 2012-05-31 09:37:20
加个GENESTAR的170KD预染marker看着条带差不多就停电泳，那个东西不贵
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5楼2012-05-30 21:38:22
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zrtpaopao

金虫 (小有名气)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
神经再生: 金币+1 2012-05-31 16:04:09
“只能看到大分子量条带，小分子的看不到”应该是转膜时间过长，小分子的转过了吧。小分子量需要的转膜时间短一些，大分子量的比较难转需要时间长一些。
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6楼2012-05-31 11:00:07
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神经再生

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by zrtpaopao at 2012-05-31 11:00:07
“只能看到大分子量条带，小分子的看不到”应该是转膜时间过长，小分子的转过了吧。小分子量需要的转膜时间短一些，大分子量的比较难转需要时间长一些。

我用的100v 2h，是不是过了？应该怎么转？谢谢
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7楼2012-05-31 16:04:46
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神经再生

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 小小神经细胞 at 2012-05-30 14:11:57
17KD的分子量的蛋白不算太小，和b-actin的条件差不多就可以，没有那么脆弱，只要你保证转膜转上了，抗体没问题，就可以做出来，我做过18KD的

你的电泳条件和转膜条件都是什么。。。谢谢!
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8楼2012-05-31 16:06:19
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geek23

木虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
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7楼: Originally posted by 神经再生 at 2012-05-31 16:04:46
我用的100v 2h，是不是过了？应该怎么转？谢谢...

100v 2小时 长了点吧
我跑survivin 16KD 转膜 100v就转一个小时 同时加冰转 控制电流不要超过0.3A  如果其他大分子量的蛋白在 很有可能是穿膜了 小分子的跑过去了
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9楼2012-05-31 17:46:38
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ajinch

金虫 (正式写手)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
神经再生: 金币+1 2012-06-01 22:55:46
我用的300mA，30min。冰水浴。0.22uM的膜。做的14kD，没有问题。
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10楼2012-05-31 21:15:42
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小小神经细胞

铁虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
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8楼: Originally posted by 神经再生 at 2012-05-31 16:06:19
你的电泳条件和转膜条件都是什么。。。谢谢!...

100v 2h有点长，但是要看你用半干转还是湿转，我用的是半干转，300mA 30min-1h都可以，0.22uM的膜，再跑一个marker，应该没什么问题
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11楼2012-05-31 21:39:45
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神经再生

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by geek23 at 2012-05-31 17:46:38
100v 2小时 长了点吧
我跑survivin 16KD 转膜 100v就转一个小时 同时加冰转 控制电流不要超过0.3A  如果其他大分子量的蛋白在 很有可能是穿膜了 小分子的跑过去了...

100v 1h条件下 42kD 的内参 actin  可不可以转过去  因为我想在同一张膜上做两个抗体，  蛋白量比较少
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12楼2012-06-01 22:57:31
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神经再生

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
10楼: Originally posted by ajinch at 2012-05-31 21:15:42
我用的300mA，30min。冰水浴。0.22uM的膜。做的14kD，没有问题。

恒流转膜？ 这个条件下不知道42kD的内参actin 可不可以转过去 因为我想在同一张膜上做两个蛋白  ，提的蛋白比较少 谢谢
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13楼2012-06-01 22:58:44
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迷情八月

金虫 (正式写手)
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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
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10楼: Originally posted by ajinch at 2012-05-31 21:15:42
我用的300mA，30min。冰水浴。0.22uM的膜。做的14kD，没有问题。

我的350mA，90min，13KD，0.45um 没问题
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15楼2012-06-02 00:45:27
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geek23

木虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
12楼: Originally posted by 神经再生 at 2012-06-01 22:57:31
100v 1h条件下 42kD 的内参 actin  可不可以转过去  因为我想在同一张膜上做两个抗体，  蛋白量比较少...

没有问题的,actin丰度比较高,还有你用的膜孔径是多大的如果是做小分子量的蛋白建议用小孔径的膜.
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16楼2012-06-02 08:23:00
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zrtpaopao

金虫 (小有名气)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
神经再生: 金币+1, 谢谢！ 2012-06-02 13:15:00
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7楼: Originally posted by 神经再生 at 2012-05-31 16:04:46
我用的100v 2h，是不是过了？应该怎么转？谢谢...

我做的有60KD 150KD左右的经常是100V转2h-2.5h，你可以尝试电压低点80V转2h或者100V转1.5h。这只是我的建议，仅供参考。
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17楼2012-06-02 09:09:50
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ajinch

金虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
12楼: Originally posted by 神经再生 at 2012-06-01 22:57:31
100v 1h条件下 42kD 的内参 actin  可不可以转过去  因为我想在同一张膜上做两个抗体，  蛋白量比较少...

一般四十kd的我也就用45min.内参我觉得一般问题不大。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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18楼2012-06-02 12:53:49
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神经再生

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
18楼: Originally posted by ajinch at 2012-06-02 12:53:49
一般四十kd的我也就用45min.内参我觉得一般问题不大。
...

湿转法？4度条件下么？ 0.22um的膜？
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19楼2012-06-02 13:13:21
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神经再生

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 小小神经细胞 at 2012-05-30 14:11:57
17KD的分子量的蛋白不算太小，和b-actin的条件差不多就可以，没有那么脆弱，只要你保证转膜转上了，抗体没问题，就可以做出来，我做过18KD的

问一下你当时转膜的条件是什么，是不是湿转！
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21楼2012-08-15 10:18:04
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小小神经细胞

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
21楼: Originally posted by 神经再生 at 2012-08-15 10:18:04
问一下你当时转膜的条件是什么，是不是湿转！...

半干转
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22楼2012-08-15 16:26:28
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1542758867

新虫 (初入文坛)
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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
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14楼: Originally posted by 神经再生 at 2012-06-01 23:00:41
用的湿转  小分子mark虽然不是很清楚了  但是还是能看得到 就是比较浅（与大分子相比）  有没有什么问题...

请问您最后是怎么弄的，我的今天也出现这个问题了，我的膜也是0.45的PVDF膜，转膜条件是80V 50min，也是分子量大的条带的mark颜色比较清楚，但是15KD的颜色就很浅了。
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23楼2016-03-24 10:17:05
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