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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 有没有人用Western blot在做17kDa蛋白质,求经验！！！
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神经再生

铁杆木虫 (著名写手)

[交流] 有没有人用Western blot在做17kDa蛋白质,求经验！！！

有没有人用Western blot在做17kDa左右的蛋白质分子
现在知道分离胶需要使用15%，转膜之后丽春红染色只能看到大分子条带，小分子的看不到。
求解：
电泳时的电压，时间应该用多少的？？？
转膜的条件又如何，比如电压、时间？？？注：本实验室使用湿转还有没有其他的注意事情，比如蛋白提取过程的问题，有人说小分子的蛋白比较容易降解。。。

[ Last edited by 神经再生 on 2012-6-4 at 09:50 ]
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1楼 2012-05-30 09:34:23
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神经再生

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by zrtpaopao at 2012-05-31 11:00:07
“只能看到大分子量条带，小分子的看不到”应该是转膜时间过长，小分子的转过了吧。小分子量需要的转膜时间短一些，大分子量的比较难转需要时间长一些。

我用的100v 2h，是不是过了？应该怎么转？谢谢
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7楼2012-05-31 16:04:46
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小小神经细胞

铁虫 (小有名气)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
神经再生: 金币+1 2012-05-31 09:36:39
17KD的分子量的蛋白不算太小，和b-actin的条件差不多就可以，没有那么脆弱，只要你保证转膜转上了，抗体没问题，就可以做出来，我做过18KD的
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2楼2012-05-30 14:11:57
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睿睿830716

新虫 (初入文坛)
★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
yqbter: 金币+2, 鼓励新虫发帖应助！ 2012-05-31 08:21:15
神经再生: 金币+1, 恒压 80mA？？ 2012-05-31 09:37:06
你可以使用预染MARKER也叫彩虹MARKER，跑完蛋白电泳之后不用染色可以清晰看到条带，在做Western blot时会很清晰，MARKER 都转到膜上你的目的条带也一定转到膜上了，一般恒压80mA，一个半小时就差不多了，17KD的分子量的蛋白肯定能转过去，也不需要丽春红染色，很方便
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3楼2012-05-30 20:05:12
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睿睿830716

新虫 (初入文坛)
你可以使用预染MARKER也叫彩虹MARKER，跑完蛋白电泳之后不用染色可以清晰看到条带，在做Western blot时会很清晰，MARKER 都转到膜上你的目的条带也一定转到膜上了，一般恒流80mA，一个半小时就差不多了，17KD的分子量的蛋白肯定能转过去，也不需要丽春红染色，很方便
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4楼2012-05-30 20:06:53
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