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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » western blot 第一次曝光有条带，而且浓厚，第二次就没有了。。。
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lengol

新虫 (初入文坛)

[交流] western blot 第一次曝光有条带，而且浓厚，第二次就没有了。。。

最近一直被这鬼东西所苦恼，就是孵了一抗二抗之后，第一次b-actin曝光条带还算可以，但是第二次曝光就没结果了，因为我的目的蛋白没有显影出来，所以想多曝光一会儿可以让他出来。但是第二次却啥都没有了，或者就是很浅。我尝试过将上样量变大，浓度是0.8，用的30ul，35ul，40ul，50ul，后来连b-catin都没了。。
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1楼 2012-06-04 12:40:58
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

yuyelin

木虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★
lengol(金币+1): 谢谢参与
silicare: 金币+3, 应助指数+1, 同问 2012-06-04 15:27:44
yqbter: 金币+1, 鼓励发帖！ 2012-06-05 08:16:37
你曝光时间多长？时间太长的话，荧光会变弱，消失的。
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2楼2012-06-04 15:13:42
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普通回帖

啊Q精神

木虫 (小有名气)
★
lengol(金币+1): 谢谢参与
显色液不行了，荧光衰减了，国产的也就最多半小时。
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3楼2012-06-04 19:55:58
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cfynocry

银虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我觉得吧曝光时间是不能太长的哈，
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4楼2012-06-05 08:44:07
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废哥117

银虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
你是用ECL显色吗？为什么要先做actin而不做目的蛋白呢？还有就是第一次和第二次是什么意思?你的膜重新孵抗体了？
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5楼2012-06-05 09:33:19
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lengol

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by yuyelin at 2012-06-04 15:13:42
你曝光时间多长？时间太长的话，荧光会变弱，消失的。

第一次曝光5min，有时候目的蛋白比较浅，就曝光第二次，时间延长到十分钟甚至半小时，显影发现美东西。。。
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6楼2012-06-05 10:32:19
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lengol

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 啊Q精神 at 2012-06-04 19:55:58
显色液不行了，荧光衰减了，国产的也就最多半小时。

就发光剂？用的thermo的，以前做的时候感觉还可以。
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7楼2012-06-05 10:32:46
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lengol

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 废哥117 at 2012-06-05 09:33:19
你是用ECL显色吗？为什么要先做actin而不做目的蛋白呢？还有就是第一次和第二次是什么意思?你的膜重新孵抗体了？

嗯，ECL，两个蛋白石一起做的，actin和目的蛋白分开孵育一抗二抗，第一次指的是第一次曝光，第二次指的是第二次曝光。第一次曝光5min应该不算长，但是有时候觉得目的蛋白的条带太浅或者没有条带，就尝试延长一下时间，然后就没任何东西，或者就只有一点背景了。。
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8楼2012-06-05 10:37:23
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废哥117

银虫 (小有名气)
★
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目的蛋白你加了AB液后黑暗中观察有没有荧光出现？如果没有的话，很多情况下压再长时间你都不会出来。
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9楼2012-06-05 15:41:55
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lengol

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 废哥117 at 2012-06-05 15:41:55
目的蛋白你加了AB液后黑暗中观察有没有荧光出现？如果没有的话，很多情况下压再长时间你都不会出来。

这个还真没有，但是有时候目的蛋白压的时间长了之后就能出现条带，而且较为清晰。但是有时候又没有，条件没有改变，总觉得很不稳定
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10楼2012-06-05 17:36:51
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frank009

禁虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
本帖内容被屏蔽
11楼2014-04-03 22:44:16
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传承

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我也遇到了这个问题，我觉得是TBST的问题。现在正在摸索中。
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12楼2015-03-26 12:50:03
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弗德_WB优化

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 啊Q精神 at 2012-06-04 19:55:58
显色液不行了，荧光衰减了，国产的也就最多半小时。

试试FD的
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13楼2015-05-12 11:46:45
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奋进的女孩

金虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
楼主的问题解决了么？我也在迷糊当中，求指点
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14楼2015-07-21 19:50:39
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