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保护你的大树

新虫 (小有名气)

[求助] western-blot 技术

我现在在做western-blot，现在的图片发现整个图片呈现云雾状，好像是一抗的浓度大了，我已经把浓度降低了，但是发现还是呈现云雾状，而且中间没有相对特别亮的地方。我想问下，在做western的时候还需要注意什么，可以尽量详细一点，谢谢哈。
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1楼2012-08-25 14:49:55
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回帖置顶 ( 共有1个 )

实心小白菜

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
小丹木木: 金币+5, MolEPI+1, 鼓励积极热心解答问题 2012-09-03 13:45:39
引用回帖:
4楼: Originally posted by 保护你的大树 at 2012-08-25 22:36:17
我是加了显影剂直接在一个照相系统照相的，上面很多时候是白的一片，正常的应该是一条白的。在抗体孵育后我先是PBST洗两遍，每遍10min，最后是用PBS，在抗体孵育的时候是1ml的PBST加50ul的5%的牛奶，（这样是不是低 ...

转没转过去，看marker上对应的条带是不是转全了，预染marker不是都能在胶上看出来么。立春红染色能说明一定问题，但是检出限和western不一样，那个得是蛋白很多的时候，立春红才能染出来颜色。你用的牛奶的浓度确实低了，可能这也导致了你的封闭不完全，我们实验室一般用5%~10%的牛奶先室温封闭一个小时，然后用1%的牛奶一抗孵育，我有时候用实验室自己做的抗体，背景比较脏，这时候我就用5%的牛奶封闭，背景就很干净了。牛奶怎么还那么金贵呢，我们一直用惠宜的脱脂奶粉，沃尔玛专供。。。再者，如果抗体浓度太大了，你洗不干净，也会造成这种情况，记住我们要的都是特异性结合，都很结实，PBST洗两次肯定是少了，我一般洗五次，血清抗体8次左右。。。。。。。。
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有啥不高兴的事儿，说出来大家乐呵乐呵~
11楼2012-08-27 18:41:18
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实心小白菜

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励交流经验 2012-08-25 20:09:43
是黑的都糊成一片么？要么继续降低浓度，要么使劲使劲洗洗试试，一抗二抗结束之后，不是都用PBST洗么。还有就是有时候用5%的牛奶做一抗孵育，能降低背景。第三，就是减少曝光时间，可以压个几秒的试试。第四就是你的转膜，是不是真的转过去了特异性的蛋白条带，第五就是蛋白的load量。western是个很复杂很欺生的活，一个条件一个条件地摸索吧~祝你好运~
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有啥不高兴的事儿，说出来大家乐呵乐呵~
3楼2012-08-25 19:31:57
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生物-TJAB

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
可能脱脂奶粉不好，含有与二抗结合的杂蛋白啊！用BSA标准牛血清白蛋白孵育试试吧！

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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5楼2012-08-25 23:44:43
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北北晴空

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
背景的问题吧。。用脱脂奶粉还是BSA封闭的？
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6楼2012-08-26 14:06:03
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jl860822

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-08-27 13:36:08
你先用相同条件做一下内参蛋白试试，看看什么效果，我怀疑你可能是没洗干净，另外我觉得你的一抗浓度不是太高，而是太低了，一般Western Blot出现问题，很有可能是一抗的问题
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10楼2012-08-27 08:24:50
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普通回帖

溜溜球@china

金虫 (小有名气)
会不会是膜转的不好呀？
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2楼2012-08-25 15:39:53
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保护你的大树

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 实心小白菜 at 2012-08-25 19:31:57
是黑的都糊成一片么？要么继续降低浓度，要么使劲使劲洗洗试试，一抗二抗结束之后，不是都用PBST洗么。还有就是有时候用5%的牛奶做一抗孵育，能降低背景。第三，就是减少曝光时间，可以压个几秒的试试。第四就是你的 ...

我是加了显影剂直接在一个照相系统照相的，上面很多时候是白的一片，正常的应该是一条白的。在抗体孵育后我先是PBST洗两遍，每遍10min，最后是用PBS，在抗体孵育的时候是1ml的PBST加50ul的5%的牛奶，（这样是不是低了？)怎样检测是否转膜成功，我现在跑完胶，在目的位置附近都没有什么颜色的，所以转膜后膜上肉眼也是干干净净的，是不是用丽春红对膜进行染色可以看出，还是直接煮胶。
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4楼2012-08-25 22:36:17
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保护你的大树

新虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 生物-TJAB at 2012-08-25 23:44:43
可能脱脂奶粉不好，含有与二抗结合的杂蛋白啊！用BSA标准牛血清白蛋白孵育试试吧！

BSA的浓度要控制到多少。
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7楼2012-08-26 22:13:37
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保护你的大树

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 北北晴空 at 2012-08-26 14:06:03
背景的问题吧。。用脱脂奶粉还是BSA封闭的？

是用脱脂奶粉封闭的。如果用BSA的话，浓度要控制到多少，封闭温度是多少，封闭多少时间。
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8楼2012-08-26 22:14:25
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保护你的大树

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 北北晴空 at 2012-08-26 14:06:03
背景的问题吧。。用脱脂奶粉还是BSA封闭的？

我还想问一下，在转膜的时候我是按照我们实验室的方法做的，就是按照转膜面积（平方厘米）的1.5倍的电流转膜20min，这样的条件是不是太弱了点，我的目的蛋白大小事43KD，
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9楼2012-08-26 22:21:52
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