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保护你的大树

新虫 (小有名气)

[求助] western-blot 技术

我现在在做western-blot,现在的图片发现整个图片呈现云雾状,好像是一抗的浓度大了,我已经把浓度降低了,但是发现还是呈现云雾状,而且中间没有相对特别亮的地方。我想问下,在做western的时候还需要注意什么,可以尽量详细一点,谢谢哈。
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实心小白菜

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励交流经验 2012-08-25 20:09:43
是黑的都糊成一片么?要么继续降低浓度,要么使劲使劲洗洗试试,一抗二抗结束之后,不是都用PBST洗么。还有就是有时候用5%的牛奶做一抗孵育,能降低背景。第三,就是减少曝光时间,可以压个几秒的试试。第四就是你的转膜,是不是真的转过去了特异性的蛋白条带,第五就是蛋白的load量。western是个很复杂很欺生的活,一个条件一个条件地摸索吧~祝你好运~
有啥不高兴的事儿,说出来大家乐呵乐呵~
3楼2012-08-25 19:31:57
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生物-TJAB

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
可能脱脂奶粉不好,含有与二抗结合的杂蛋白啊!用BSA标准牛血清白蛋白孵育试试吧!

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
5楼2012-08-25 23:44:43
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北北晴空

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
背景的问题吧。。用脱脂奶粉还是BSA封闭的?
6楼2012-08-26 14:06:03
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jl860822

金虫 (正式写手)


【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-08-27 13:36:08
你先用相同条件做一下内参蛋白试试,看看什么效果,我怀疑你可能是没洗干净,另外我觉得你的一抗浓度不是太高,而是太低了,一般Western Blot出现问题,很有可能是一抗的问题
10楼2012-08-27 08:24:50
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普通回帖

溜溜球@china

金虫 (小有名气)

会不会是膜转的不好呀?
2楼2012-08-25 15:39:53
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保护你的大树

新虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 实心小白菜 at 2012-08-25 19:31:57
是黑的都糊成一片么?要么继续降低浓度,要么使劲使劲洗洗试试,一抗二抗结束之后,不是都用PBST洗么。还有就是有时候用5%的牛奶做一抗孵育,能降低背景。第三,就是减少曝光时间,可以压个几秒的试试。第四就是你的 ...

我是加了显影剂直接在一个照相系统照相的,上面很多时候是白的一片,正常的应该是一条白的。在抗体孵育后我先是PBST洗两遍,每遍10min,最后是用PBS,在抗体孵育的时候是1ml的PBST加50ul的5%的牛奶,(这样是不是低了?)怎样检测是否转膜成功,我现在跑完胶,在目的位置附近都没有什么颜色的,所以转膜后膜上肉眼也是干干净净的,是不是用丽春红对膜进行染色可以看出,还是直接煮胶。
4楼2012-08-25 22:36:17
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保护你的大树

新虫 (小有名气)

引用回帖:
5楼: Originally posted by 生物-TJAB at 2012-08-25 23:44:43
可能脱脂奶粉不好,含有与二抗结合的杂蛋白啊!用BSA标准牛血清白蛋白孵育试试吧!

BSA的浓度要控制到多少。
7楼2012-08-26 22:13:37
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保护你的大树

新虫 (小有名气)

引用回帖:
6楼: Originally posted by 北北晴空 at 2012-08-26 14:06:03
背景的问题吧。。用脱脂奶粉还是BSA封闭的?

是用脱脂奶粉封闭的。如果用BSA的话,浓度要控制到多少,封闭温度是多少,封闭多少时间。
8楼2012-08-26 22:14:25
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保护你的大树

新虫 (小有名气)

引用回帖:
6楼: Originally posted by 北北晴空 at 2012-08-26 14:06:03
背景的问题吧。。用脱脂奶粉还是BSA封闭的?

我还想问一下,在转膜的时候我是按照我们实验室的方法做的,就是按照转膜面积(平方厘米)的1.5倍的电流转膜20min,这样的条件是不是太弱了点,我的目的蛋白大小事43KD,
9楼2012-08-26 22:21:52
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