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实心小白菜

新虫 (初入文坛)

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专业: 生物化学

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
小丹木木: 金币+5, MolEPI+1, 鼓励积极热心解答问题 2012-09-03 13:45:39

引用回帖:

4楼: Originally posted by 保护你的大树 at 2012-08-25 22:36:17
我是加了显影剂直接在一个照相系统照相的，上面很多时候是白的一片，正常的应该是一条白的。在抗体孵育后我先是PBST洗两遍，每遍10min，最后是用PBS，在抗体孵育的时候是1ml的PBST加50ul的5%的牛奶，（这样是不是低 ...

转没转过去，看marker上对应的条带是不是转全了，预染marker不是都能在胶上看出来么。立春红染色能说明一定问题，但是检出限和western不一样，那个得是蛋白很多的时候，立春红才能染出来颜色。你用的牛奶的浓度确实低了，可能这也导致了你的封闭不完全，我们实验室一般用5%~10%的牛奶先室温封闭一个小时，然后用1%的牛奶一抗孵育，我有时候用实验室自己做的抗体，背景比较脏，这时候我就用5%的牛奶封闭，背景就很干净了。牛奶怎么还那么金贵呢，我们一直用惠宜的脱脂奶粉，沃尔玛专供。。。再者，如果抗体浓度太大了，你洗不干净，也会造成这种情况，记住我们要的都是特异性结合，都很结实，PBST洗两次肯定是少了，我一般洗五次，血清抗体8次左右。。。。。。。。

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有啥不高兴的事儿，说出来大家乐呵乐呵~

11楼2012-08-27 18:41:18

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保护你的大树

新虫 (小有名气)

应助: 0 (幼儿园)
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引用回帖:

10楼: Originally posted by jl860822 at 2012-08-27 08:24:50
你先用相同条件做一下内参蛋白试试，看看什么效果，我怀疑你可能是没洗干净，另外我觉得你的一抗浓度不是太高，而是太低了，一般Western Blot出现问题，很有可能是一抗的问题

谢谢你哈。

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12楼2012-09-03 08:43:06

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lvanmorison

禁虫 (初入文坛)

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13楼2012-12-13 00:28:47

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