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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » western blot没有结果是怎么回事~~
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马龙sweeting

木虫 (正式写手)

[交流] western blot没有结果是怎么回事~~

自己摸索着做western，但是做了3次western blot没有结果，也不知道是哪里有问题，换用别人的抗体也不行，我做western是菜鸟，也不知道究竟哪里出了问题，请各位老手能够提出一些我可能出问题的地方，不胜感激~~
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1楼 2013-03-19 14:33:13
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robustli

银虫 (小有名气)
★
马龙sweeting(金币+1): 谢谢参与
the best way to test your system is using a positive control.
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5楼2013-03-20 04:11:33
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★
马龙sweeting(金币+1): 谢谢参与
如果你用别人的抗体也不行，说明问题可能是胶、转膜或者是后面的detection。胶跑得怎么样？上样多少，是否染胶观察？此外，膜转得怎么样？有预染marker吗？一抗、二抗是否都好用。用什么检测？是曝光film吗？
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4楼2013-03-20 04:04:22
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myfinalway

木虫 (正式写手)
★
马龙sweeting(金币+1): 谢谢参与
WB 步骤多，每一步都有可能影响，你要一个一个排除。
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6楼2013-03-20 09:54:22
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concon123456

铜虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
二抗用了免荧光的！
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7楼2013-03-21 09:57:23
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fengqingrusi

金虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
最好要有正对照，转膜是很关键的一步，如果没有转膜成功有可能就没有结果，还有就是加上预染的marker, 方便检测转膜效率和判断目的蛋白的大小。抗体的孵育也很关键，我们一般的做法是一抗在4度孵育过夜，让后洗三遍，二抗一般室温孵育一个小时就可以了。祝你好运！
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8楼2013-03-21 20:19:09
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cucu奶茶

银虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
做个内参看看出不出条带。若是出了，说明整个过程没问题。可以考虑适当升高一抗浓度。
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9楼2013-03-22 09:34:40
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马龙sweeting

木虫 (正式写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by cucu奶茶 at 2013-03-22 09:34:40
做个内参看看出不出条带。若是出了，说明整个过程没问题。可以考虑适当升高一抗浓度。

我做的就是内参~~
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10楼2013-03-24 20:09:03
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马龙sweeting

木虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by fengqingrusi at 2013-03-21 20:19:09
最好要有正对照，转膜是很关键的一步，如果没有转膜成功有可能就没有结果，还有就是加上预染的marker, 方便检测转膜效率和判断目的蛋白的大小。抗体的孵育也很关键，我们一般的做法是一抗在4度孵育过夜，让后洗三遍 ...

我在别人的用我的样品实验室做的就没有问题~~怀疑可能是抗体的问题~~
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11楼2013-03-24 20:10:09
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taomm

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
这个涉及的问题太多了。内参没出的话，看看你一二抗种属是否对应；转印是否成功（可以通过预染MARKER）确认；内参是否能在你的抗原上工作（这个一般会有商品说明）；试剂（特别是发光底物）是否合适。然后就是一二抗的工作稀释度。
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12楼2013-03-25 14:06:28
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柳林竹风

银虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
刚做时，最好先联系做内参，内参若是出不来，再考虑其他因素~
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13楼2014-05-25 20:18:49
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简单回复
haixiawu2楼
2013-03-19 17:21   回复  
马龙sweeting(金币+1): 谢谢参与
yingying15883楼
2013-03-19 21:18   回复  
马龙sweeting(金币+1): 谢谢参与
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