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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » Western Blot的问题（关于重复性和显色）
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hia_25

铁虫 (小有名气)

[求助] Western Blot的问题（关于重复性和显色）

WB新手，最近遇到很多WB问题，下面一一列举，请各问高手指教啊！

1，前段时间做内参基因GAPDH，一直都挺好，最近两次用的是相同的条件（一抗、二抗、显色液用的是一样的），可能稍微不同的就是上样量从20ug变成10ug，封闭时间每次比较随意，半小时到一小时不等，一抗有时在4度过夜，有时室温两小时到三小时，TBST洗的次数有时候7、8次，有时3、4次，二抗室温70min，这些不同在我的理解对结果没有致命影响，不知道对不对啊？

2，都说ECL显色液加到膜上后，需要孵育1~2min，可是我的是加上后就有很强的荧光，而且荧光持续的时间大概就5~6min就猝灭了，这是什么原因呢？有人说是二抗浓度过高，导致底物很快消耗，但是我降低二抗的浓度同时也降低上样量了（20ug，不算大吧？），还是一样很快猝灭。用的是天根ECL，怎么办呢？会不会是每次去暗室都把显色液在常温放一段时间，然后不好了？

再次感谢！
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1楼 2012-07-26 09:35:33
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玉杰何何

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
hia_25: 金币+3 2012-10-08 10:00:12
可能是ECL发光液失效了，换新的试试
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2楼2012-08-17 13:40:28
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hia_25

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 玉杰何何 at 2012-08-17 13:40:28
可能是ECL发光液失效了，换新的试试

非常感谢，终于有一个回复了，呵呵，我以为我的金币给少了大家都不愿睬我，我也是没办法，总共就只有五个金币！

现在问题已经解决了，就是发光液的灵敏度不够高，后来换了超敏的就好了！
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3楼2012-10-08 09:58:13
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灵岩苏

禁言 (小有名气)
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4楼2013-03-12 11:18:17
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大柏树

禁言 (小有名气)
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5楼2013-03-21 09:40:55
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灵岩苏

禁言 (小有名气)
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6楼2013-05-02 16:52:51
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biowhb

银虫 (正式写手)
淬灭太快，用TBST多洗几次，再显影。荧光还是很强的话，在蛋白处多加点ECL。显影要快，中间空了，就不要显影，回去再重新洗，再做。你要是对显影结果不满意，把预留的蛋白重跑一下。
楼主对质量很在意的话，中间过程一定要等，不要偷工减料。
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生物技术-基因工程制药
7楼2013-05-13 15:45:21
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hia_25

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by biowhb at 2013-05-13 15:45:21
淬灭太快，用TBST多洗几次，再显影。荧光还是很强的话，在蛋白处多加点ECL。显影要快，中间空了，就不要显影，回去再重新洗，再做。你要是对显影结果不满意，把预留的蛋白重跑一下。
楼主对质量很在意的话，中间过 ...

非常感谢，现在这个淬灭快的问题解决了，就是发光液不好，后来换了个好的就好了。但是还有一个问题很困扰我，这个问题如图：这是杂的内参GAPDH，实在有点惨不忍睹，见笑了，我很不明白为什么条带会成这个样子，我每次的操作基本都差不多，也很小心，气泡也赶得很干净，孵育抗体的时候都是用手套做成小袋子孵育，条带间接触抗体也不会如此不均匀啊，还会有什么原因导致这样的惨象呢？
Western Blot的问题（关于重复性和显色）
G.jpg
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8楼2013-07-01 10:36:57
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yiyun

金虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by hia_25 at 2013-07-01 10:36:57
非常感谢，现在这个淬灭快的问题解决了，就是发光液不好，后来换了个好的就好了。但是还有一个问题很困扰我，这个问题如图：这是杂的内参GAPDH，实在有点惨不忍睹，见笑了，我很不明白为什么条带会成这个样子，我每 ...

边缘弱应该是转膜不均匀导致的，可以尝试调整好三明治结构，或者把边上的lane加空白样品。band形状奇怪可能是曝光问题，尝试减少曝光时间试试。
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9楼2013-07-05 00:28:57
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hia_25

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 大柏树 at 2013-03-21 09:40:55
楼主用的是哪家的ECL，灵敏度怎样的？

我们用的是天根的，不知道是时间久了，还是真的灵敏度不高，反正就是检测不出来我的目的条带，不过检测内参没有问题。
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10楼2013-07-05 09:07:25
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