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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助：两种蛋白融合原核表达的问题
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ygdeying_11

铁虫 (小有名气)

[求助] 求助：两种蛋白融合原核表达的问题 已有2人参与

小弟采用BL21、质粒pet28a进行原核表达。将A，B两种基因串联在一起，形成“A-linker-B”。
原核诱导后，考马斯亮蓝染色显示，目的大小处有条带，且用His标签进行Western Blot可显出目的蛋白。
但是当我用B蛋白的抗体做Western时，却显不出条带，我不太理解，请各位大牛给些指点。

有人说可能A-B在一起后影响了B的结构，但是Western样品是煮沸变性的，应该只有线性的一级结构了吧，那为什么抗体可以显出变性的B，却显不出变性的A-B？
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1楼 2014-01-16 10:53:39
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

fuyuandj86

版主 (著名写手)

己所不欲，勿施于人
★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
ygdeying_11(kx444555代发): 金币+3, 鼓励交流 2014-01-17 12:49:42
你的判断是正确的,上样到胶的都是变性的蛋白,WB的抗体只识别一级结构
我只能建议你再检查一下B抗体做WB的方法，包括稀释比例，二抗选择之类的
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The doer of good becomes good, the doer of evil becomes evil.
2楼2014-01-16 23:44:45
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ygdeying_11

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by alicelchf at 2014-01-18 22:28:54
你是如何确定表达是a-Linker-b蛋白的？...

1.考马斯亮蓝染色，蛋白大小符合预期。
2.用His标签抗体进行WB，可显出该蛋白
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6楼2014-02-12 14:44:30
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yang0071

木虫 (职业作家)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
谁说 煮沸后，就是一级结构了
拉出去tjjtds
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7楼2014-02-12 14:56:45
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wpq787899

铁虫 (初入文坛)
楼主，你好，我想咨询一个问题，在做融合表达时基因A的终止密码子是否需要去除？
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11楼2016-01-15 09:30:09
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moychan

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
11楼: Originally posted by wpq787899 at 2016-01-15 09:30:09
楼主，你好，我想咨询一个问题，在做融合表达时基因A的终止密码子是否需要去除？

当然得删，不删后面的怎么表达

发自小木虫Android客户端
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13楼2016-05-05 20:46:35
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普通回帖

alicelchf

木虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
你确定是你的蛋白a-linker-b吗？b单独表达的时候，wb是否可以正常显色呢
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修身、齐家、治国、平天下
3楼2014-01-17 13:44:02
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ygdeying_11

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by alicelchf at 2014-01-17 13:44:02
你确定是你的蛋白a-linker-b吗？b单独表达的时候，wb是否可以正常显色呢

是A-linker-B，B单独表达的时候，wb可以正常显色
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4楼2014-01-18 21:32:30
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alicelchf

木虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
4楼: Originally posted by ygdeying_11 at 2014-01-18 21:32:30
是A-linker-B，B单独表达的时候，wb可以正常显色...

你是如何确定表达是a-Linker-b蛋白的？
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修身、齐家、治国、平天下
5楼2014-01-18 22:28:54
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jiaolong11a

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
A和B连接时，会不会连接点正好是B抗体的识别位点，抗体当然识别不了了
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多情总被无情扰。。。愁
8楼2014-02-13 09:08:50
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Allen206

银虫 (小有名气)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-02-13 19:13:01
单独的B抗原表位是哪几个氨基酸？是线性表位还是空间？融合后抗原表位到哪去了？是在表面还是折叠在内部？
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不想说什么，，，，
9楼2014-02-13 10:05:50
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shenhaiwang

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-02-13 19:12:50
B蛋白的抗体是单抗还是多抗？如果是单抗的话，可能是抗原表位破坏；多抗的话，建议在重复做一遍，看看是否还会出现相应结果
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10楼2014-02-13 18:48:25
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