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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » Western blot 有没有大仙做过Cleaved caspase-3(17kD),求操作经验啊！
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神经再生

铁杆木虫 (著名写手)

[求助] Western blot 有没有大仙做过Cleaved caspase-3(17kD),求操作经验啊！

Western blot 有没有大仙做过Cleaved caspase-3(17kD),求心得，求经验！
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也许似乎大概是，然而未必不见得。
1楼 2012-08-15 10:22:11
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

豆龟

新虫 (初入文坛)
楼主现在做的进展如何呢？我现在也是打算做斑马鱼蛋白的caspase 3的WB，之前用abcam的抗体做了，但没有出条带，请问你用的哪家的抗体？
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7楼2012-11-28 12:00:21
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普通回帖

zjutheone

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
神经再生: 金币+10, ★★★很有帮助, 不错！ 2012-10-10 22:22:47
常规操作，胶用12%是没问题的，30微克的上样量，100V，湿转1小时就可以了。
western时，测定cleaved caspase-3，total caspase-3和β-actin都要做。
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2楼2012-10-09 17:16:31
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15929819216

新虫 (初入文坛)
★ ★ ★
看天: 金币+3, 新 鼓励 常来 2012-10-12 14:25:56
请问一下，你用什么仪器，是Bio-Red 吗，你100V恒压转时，电流是多大的，敬待回音。。。
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3楼2012-10-12 13:35:46
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david0308

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
神经再生: 金币+5 2013-04-05 11:14:00
一般来说你的分子量较小，可以考虑一下小分子胶。如果不会的话其实12%或者15%的胶也可以，90V15min后再120V不超过一个小时，转膜的时候横流两个小时就好，然后膜要用0.2um孔径的，别用0.45的，要不可能会转出去。
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哈哈
4楼2012-10-16 20:30:35
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15929819216

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
神经再生: 金币+5 2013-04-05 11:13:45
我们是bio-red湿转，一个小时十分钟，由转出来的，但重复不出来了，可以试试，恒流200mA,有好的建议的请回复，
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5楼2012-11-15 16:55:58
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豆龟

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zjutheone at 2012-10-09 17:16:31
常规操作，胶用12%是没问题的，30微克的上样量，100V，湿转1小时就可以了。
western时，测定cleaved caspase-3，total caspase-3和β-actin都要做。

请问您用的是哪家的caspase 3抗体呢
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6楼2012-11-28 11:58:11
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神经再生

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 豆龟 at 2012-11-28 12:00:21
楼主现在做的进展如何呢？我现在也是打算做斑马鱼蛋白的caspase 3的WB，之前用abcam的抗体做了，但没有出条带，请问你用的哪家的抗体？

cells signal现在能做的出来，但是偶尔会出很不好看的条带，很惆怅
15%胶电泳，湿转100V100min-2h都是可以的
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也许似乎大概是，然而未必不见得。
8楼2012-11-29 12:32:40
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乖乖宝贝

金虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 神经再生 at 2012-11-29 12:32:40
cells signal现在能做的出来，但是偶尔会出很不好看的条带，很惆怅
15%胶电泳，湿转100V100min-2h都是可以的...

我想问下，湿转100V,100min ,做出来的是17KD一个条带，还是35和17一起出来了。同时想问下，出现Pro cleaved caspase-3  与药物作用的时间有关系吗？最近我也在做，35KD很容易就出条带了，但是17KD的老是出不来。
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尽自己最大的努力，优秀毕业！
9楼2013-02-19 14:06:18
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神经再生

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 乖乖宝贝 at 2013-02-19 14:06:18
我想问下，湿转100V,100min ,做出来的是17KD一个条带，还是35和17一起出来了。同时想问下，出现Pro cleaved caspase-3  与药物作用的时间有关系吗？最近我也在做，35KD很容易就出条带了，但是17KD的老是出不来。...

35kD处的条带应该是Pro-caspase-3，即caspase-3前体分子。它在实验中不会有明显的变化，一般都会作为参考的。（出现这个条带应该是抗体的原因）
17kD的cleave caspase-3实在不是太好做，我现在就是用的100V,100min 进行湿转，是有条带出现的。不知道你的蛋白浓度多少，增加上样量试试吧。
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也许似乎大概是，然而未必不见得。
10楼2013-02-20 08:41:31
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