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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助western mark 转膜不全，急！
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微露晨曦

新虫 (初入文坛)

[求助] 求助western mark 转膜不全，急！

我用的湿转，蛋白分子量分别是220,54,36，电泳时挺好，mark都出来了，转膜的时候发现大分子量的mark没出来，我转膜的条件是300mA,电压最大。请各位给分析一下什么原因啊
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1楼 2012-05-20 20:56:03
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atlanticwi

金虫 (正式写手)

琴美喜欢发呆 不喜欢发脾气

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励应助 2012-05-21 13:38:47
嗯....................
       不知道为什么总觉得你这几个蛋白放一起转有点勉强 我以前也是听别人说湿转法很好（自己一直用半干法） 能将Marker整个都上去 但我自己用MBI的Marker从来都没有这个效果 要不就是小分子量的集中在一起（80下）要不就是大分子量的一起（120上）大分量一般明显出现在膜上时 小分量的绝对就被打穿到下滤纸.....调整电流和转膜时间都起不到好效果.......所以就放弃了
       总之个人觉得调整电流没有什么用处 应该在Buffer上下功夫 有没有加甲醇 SDS之类的或者就干脆把这几种蛋白分开来转会好些吧
       个人看法 若有说错请高手指点
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Let God do with it as He wills
2楼2012-05-20 21:20:24
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蛋蛋宝贝

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
分子量大的蛋白使用浓度低的胶，转膜时间延长
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3楼2012-05-20 21:29:55
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微露晨曦

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by atlanticwi at 2012-05-20 21:20:24:
嗯....................
       不知道为什么总觉得你这几个蛋白放一起转有点勉强 我以前也是听别人说湿转法很好（自己一直用半干法） 能将Marker整个都上去 但我自己用MBI的Marker从来都没有这个效果 要不就是小 ...

我前面都转出来了，但是这几次都没出来，一样的条件啊，我的Buffer里没有加SDS，甲醇含量20%
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4楼2012-05-20 22:15:06
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微露晨曦

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 蛋蛋宝贝 at 2012-05-20 21:29:55:
分子量大的蛋白使用浓度低的胶，转膜时间延长

我用的是10%的分离胶，4%的浓缩胶。还没试过把时间延长，因为前面做的都转出来了
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5楼2012-05-20 22:18:39
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rainblue007

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
降低电压，延长转膜时间。
夏天了，试验方法要进行相应调整。
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6楼2012-05-21 14:44:15
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小梦花花

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
分子量差的这么大，一起转不是很好吧。等大分子的转过去，小分子的都快转跑，还是应该分开跑。
大分子量的转膜工作液跟小分子的不一样。甲醇含量应降低，同时加点0.1%SDS.
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7楼2012-05-21 16:19:53
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380218013

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-05-23 14:09:12
分子量多大都可以转上去的。我们实验室一直是全湿法转的，很好。不过最近也出现这种问题就是转膜不是很好。Maker有 但是小分子的不清楚。我建议你考马斯亮蓝染一下转膜后的胶，看胶上蛋白。在立春红染一下膜上的。我们分析很可能是缓冲液的PH原因！
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好好生活，努力赚钱
8楼2012-05-23 13:09:13
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