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Hzhenping新虫 (小有名气)
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求助Western Blot实验条带没出现的原因分析及解决办法 已有4人参与
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去年下半年做了一段时间WB实验，前田再次做，只换了个一抗和细胞裂解液，其他都没变（当然目的蛋白也不同了）。去年能出条带，这次却不能了。。。 现将改变的试剂及可疑操作罗列如下，供大神分析并搭救  1.细胞裂解液：RAPI细胞裂解液（强），碧云天生物技术研究所； 2.一抗:Isotype, IgG; Host, Rabbit; Species Reactivity, Human, Rat。 二抗：Goat Anti-Rabbit IgG. 3.目的蛋白大小约21KD，内参用GAPDH，于27KD-18KD处剪膜。一抗用5%BSA1:1500稀释，37oC孵育90min；二抗用5%BSA1:3000稀释,37oC孵育90min。 4.DAB显色试剂盒显色。PVDF膜的熊样如下：A 今天做了点蛋白试验（有叫“点杂交”），膜泡甲醇，晾干；蛋白样品（4个）按20ug/10ul加2xLoading Buffer煮沸后点于膜上,干后封闭，孵一抗，二抗，显色。PVDF膜熊样如下：B、C。（白斑之间即为蛋白点样点，由于膜被封闭液和5%BSA浸透而呈现这样）  A.jpg  B.jpg  C.jpg |
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 蛋白质生物学实验经验 |
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Hzhenping2楼2014-07-10 07:48:19
Hzhenping
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4楼2014-07-11 11:26:57
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5楼2014-07-11 19:59:32
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一、Western Blot实验条带没出现的原因分析及解决办法 ： 原因分析 解决办法 1.一抗和二抗失效 1. 更换抗体；选择现用现配的工作液 2.一抗和二抗不匹配 2. 更换为同种同属的同亚型的抗体底物 3.发光液失效 3. 更换新的发光液 4.抗体染色不充分 4. 增加抗体浓度；延长孵育时间 5.被测样品中不含有目的蛋白质或者目的 蛋白质含量太低 5. 设置阳性对照。确定标本中是否含有目的蛋白质； 增加样品 的上样量。 6. 溶液中有辣根过氧化物酶的抑制剂 6.用透析和超滤除去所用溶液中如叠氮化钠之类的抑制剂 7.抗体活力降低 7.在抗体活力保存时间内使用抗体；工作液现用现配 二、WB出现白斑是因为转膜过程有气泡存在；或者抗体的分布不均匀，孵育抗体时要使用摇床。 三、剪好的PVDF膜在使用前需要甲醇里泡1-2min，在零度的转膜液中孵育3-5min。 意见仅供参考。 |
6楼2014-07-11 23:54:30
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