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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白电泳/WB » western blot问题求助
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z8411909

新虫 (小有名气)

[求助] western blot问题求助 已有5人参与

今天做WB结果曝光后，胶片上什么都没有，曝光时间为5min和10min。（刚刚才开始学习做WB），整个过程很顺利，但就是爆不出结果。求助这是什么情况啊？
大概过程如下：  制胶和蛋白定量共用时1h        跑胶过程中没有出现什么非正常情况      正常转膜   用脱脂奶粉封闭1h   TBS.T清洗3次每次10min  敷一抗过夜4C‘冰箱（第二天取出来后又在37C摇床中摇了1h）   TBS.T清洗3次每次10min  二抗1.5h   TBS.T清洗3次每次10min  发光液A:B=1:1（总液与TBS比值为1:3） 曝光5min 10min 都没有背景
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1楼 2014-06-07 15:03:53
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aloha

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
z8411909: 金币+1, 我们的2抗用了一个月了吧 所以我才把时间相对加长 2014-06-08 13:05:17
用丽春红染色看看 NC膜上的蛋白 ；建议，二抗时间太长了，30min； 做出白板有太多可能，重新做吧
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信仰科学,文献无界
2楼2014-06-07 17:51:48
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逍潇

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
z8411909: 金币+1, 做内参了 用的bata-actin 内参蛋白也没有条带 2014-06-08 13:06:56
先按楼上所说用丽春红染膜看看蛋白转上了没有，然后用内参的抗体检测，看看最后能不能曝出条带来。借这个贴子吐个槽，为什么那么多人做WB不先做内参，或是跑胶不点Marker的，这样出了问题都不知问题出在哪。
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3楼2014-06-07 18:24:26
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
silicare: 金币+5, 谢谢参与 2014-06-11 10:47:33
1. 你用的是什么marker，现在一般都用预染Marker，你的膜上有marker带吗，确定不是转膜转反了？

2. 你杂的目的蛋白是什么，这个蛋白的抗体是否被证明肯定好用？

3. 发光液A:B=1:1（总液与TBS比值为1:3）
总液与TBS比值为1:3是什么意思？总液进行稀释吗？

4. 建议先做个内参蛋白的条带，内参的抗体一般都比较好用
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学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
4楼2014-06-07 19:22:54
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
如果你不差钱，可以考虑博乐的V3

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5楼2014-06-07 20:54:06
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逍潇

铁杆木虫 (著名写手)
你用bata-actin内参蛋白也没有条带，说明整个WB体系存在问题。一步步排除吧，先看转膜有没有问题，如果确信内参抗体没有问题话检查下二抗和发光液，将稀释后的二抗与配好的发光液混合，看有没有荧光。
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6楼2014-06-08 14:02:52
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z8411909

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 逍潇 at 2014-06-08 14:02:52
你用bata-actin内参蛋白也没有条带，说明整个WB体系存在问题。一步步排除吧，先看转膜有没有问题，如果确信内参抗体没有问题话检查下二抗和发光液，将稀释后的二抗与配好的发光液混合，看有没有荧光。

嗯 谢谢了
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7楼2014-06-08 22:59:40
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youlan1027

金虫 (小有名气)
我们实验室偶尔也会出现这种情况，再孵一次二抗就出来了

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静静等待
8楼2014-06-08 23:49:48
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123n

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
为什么不用化学发光呢？感觉是你的转膜有问题……

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9楼2014-06-09 00:13:00
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lmx198918

金虫 (小有名气)
加发光液看有没有条带  如果没有 用考马斯染液看蛋白有没有转上  或者转过了
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icanplay
10楼2014-06-22 19:27:28
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