| 查看: 4246 | 回复: 13 | |||||
[交流]
原创首发：Tips for Western Blot-一些小技巧而已 已有7人参与
|
|||||
|
大部分是自己实验中发现和使用的，也有其他人的经验方法，一并总结进来，谢谢支持。我用的湿转，PVDF膜，0.22，部分tips有局限性，酌情使用。 1、转膜后，有时需要确定两道样品的间隙，以便从中裁开分别敷抗体。 最简单的方法是：转膜完毕，稍用力挤干转移缓冲液，镊子夹起膜的一角，轻轻风干（我会吹口气加速），在半干不干的时候正面会显示出蛋白的柱状痕迹，因为结合了蛋白的地方干的慢，间隙干的快先变白。 如果动作快，裁完直接泡TBS可以完全浸润，否则需要先泡一下甲醇再封闭。不影响结果。 当然也可以用丽春红染色，不但能显示条带位置，而且可以知道蛋白跑的整不整齐，上样量是否一致。 或者在需要区分的样品间加一道Marker。 2、曝光完成，膜就没用了。但是我会把膜扔到稀释一百倍左右的考马斯亮蓝染色液里。过阵子取出清水冲几遍，晾干，就可以观察到明显的蛋白条带。可以用透明胶粘到实验记录本里做参考。 3、转膜完，剩下的胶也扔到稀释二十倍的考马斯亮蓝染色液里。几个小时后可以直接观察条带。染胶的染液需要比上面染膜的浓一点。 4、我们的PVDF膜是成卷的，50cm宽，经常被裁的长长短短东一块西一块。有时候我会按制胶的梳子齿的宽度预先裁成长条，以后再裁不同宽度下来就行啦。 5、关于分离胶浓度的选择，区分30kd以下的蛋白一般用12~15%的胶，40~80左右的用12%就行，大于90KD的最好用8~6%。 但是，如果不小心配的胶浓度偏低，用小电压小电流慢慢跑，也能凑活用。至于偏高，大不了多跑一会儿，就是要注意防止升温过高。 6、转膜的电流：湿转，我用恒流。40kd左右，180mA 3h， 或者200mA 1h45',效果一致。 大于100kd, 200~250 mA, 2h。 一般分子量越大转膜的电流和时间相应延长就可以。 7、一抗的节省：上次学了用保鲜膜包裹膜和抗体液4度孵育过夜，果然很省。就是不易回收。 为了利于回收，我一般只用TBS稀释一抗。同时为了降低非特异结合，延长封闭时间，4度过夜孵一抗，都是必要的。 8、曝光，第一张片子我习惯同时曝两张。万一背景较强，第一张可以滤去一部分。也防止同时曝光的多种条带，有的太浓有的太淡。 9、新买的抗体，多试几个稀释度还是挺有益处的，分装成小包装保存也利于延长保质期。 10、转完膜不能继续做，可以把膜晾干保存在干净自封袋中。下次用甲醇浸透，TBS洗一下,接着封闭就行了。 暂时想起来这些，欢迎补充。 谢谢回帖~~ 祝大家western顺利！ [ Last edited by baisuilan on 2009-7-22 at 13:48 ] |
回复此楼» 收录本帖的淘帖专辑推荐
 分子生化实验经验积累 | 有价值的生物经验贴 |
» 猜你喜欢
求调剂，一志愿厦门大学，生物与医药，总分272，本科211
已经有4人回复
-
材料调剂
已经有5人回复
-
一志愿 江南大学 085602 化工专硕 338分求调剂
已经有9人回复
-
0854电子信息319求调剂（接受跨专业调剂）
已经有3人回复
-
找调剂
已经有8人回复
-
售SCI一区文章，我:8.O.5.5.1.O.5.4,科目齐全,可+急
已经有3人回复
-
求调剂
已经有3人回复
-
生物与医药273求调剂
已经有4人回复
-
327求调剂
已经有4人回复
-
材料调剂
已经有5人回复
» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- western blot中蛋白质转印问题
已经有17人回复
- Western Blot实验的蛋白条带都连在一起
已经有37人回复
- western blot 求助，请高手指点一下
已经有8人回复
- 关于western blot显影液
已经有9人回复
- 关于Western blot的抗体孵育阶段
已经有7人回复
- 关于western blot转膜
已经有20人回复
- 新手求助western blot
已经有22人回复
- 【求助/交流】western blot的内参总是不齐怎么办
已经有19人回复
- 【求助/交流】请教大分子量蛋白western blot转膜的一些问题
已经有10人回复
- 【求助/交流】western blot中的怪现象，求解~~~
已经有19人回复
- 【求助/交流】有关western-blot的一些问题
已经有18人回复
- 【求助/交流】western blot用奶粉封闭的原理
已经有18人回复
zjwang
木虫 (正式写手)
- 应助: 1 (幼儿园)
- 金币: 2773.4
- 散金: 528
- 红花: 4
- 帖子: 626
- 在线: 302.5小时
- 虫号: 692528
- 注册: 2009-01-14
- 专业: 植物生理与生化
2楼2009-07-30 18:51:38
| 能。。。。 |
3楼2009-07-31 09:15:07
350784478
木虫 (正式写手)
- 应助: 3 (幼儿园)
- 贵宾: 0.882
- 金币: 1255.8
- 散金: 12
- 红花: 3
- 帖子: 835
- 在线: 91.4小时
- 虫号: 576561
- 注册: 2008-06-20
- 性别: GG
- 专业: 遗传学研究新技术与方法
4楼2009-07-31 09:44:48
bioman9810
木虫 (著名写手)
千娇百媚是哥的妞儿
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 1651.6
- 帖子: 1347
- 在线: 44分钟
- 虫号: 581788
- 注册: 2008-07-18
- 性别: GG
- 专业: Helix
5楼2009-07-31 10:09:18
6楼2010-05-12 13:45:41
lyg7720349
铜虫 (小有名气)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 75.2
- 帖子: 145
- 在线: 9小时
- 虫号: 941449
- 注册: 2010-01-12
- 性别: GG
- 专业: 生物大分子结构与功能
7楼2010-05-12 14:02:31
liyong1981 
金虫 (正式写手)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 774.1
- 散金: 116
- 帖子: 905
- 在线: 35.2小时
- 虫号: 357405
- 注册: 2007-04-27
- 性别: GG
- 专业: antibody
8楼2010-05-12 16:38:41
liyong1981
金虫 (正式写手)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 774.1
- 散金: 116
- 帖子: 905
- 在线: 35.2小时
- 虫号: 357405
- 注册: 2007-04-27
- 性别: GG
- 专业: antibody
9楼2010-05-12 16:40:21
liyong1981
金虫 (正式写手)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 774.1
- 散金: 116
- 帖子: 905
- 在线: 35.2小时
- 虫号: 357405
- 注册: 2007-04-27
- 性别: GG
- 专业: antibody
10楼2010-05-13 10:58:01
120