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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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xiajing_acm

新虫 (小有名气)


[交流] 【求助】虚心向大家求教western blot

各位大侠好!最近开始做western blot,我是新手,所以有些问题请教下大家:
1、从细胞中提蛋白时细胞数一般要达到多少啊?用6孔板长满细胞够吗?
2、蛋白上样量一般多少合适呢?还有上样体积?
3、检测的时候用DAB显色行吗?显色后是直接拍照还是用凝胶成像系统保存结果?
   用ECL怎样保存结果呢?
   新手,所以请各位大侠帮助下我!十分感谢!
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huangwensh

木虫 (著名写手)


★ ★
xiajing_acm(金币+1):谢谢参与
qinhy(金币+1):多谢回帖交流,欢迎常来药学版! 2011-01-13 19:16:49
引用回帖:
Originally posted by xiajing_acm at 2010-11-30 18:08:58:
各位大侠好!最近开始做western blot,我是新手,所以有些问题请教下大家:
1、从细胞中提蛋白时细胞数一般要达到多少啊?用6孔板长满细胞够吗?
2、蛋白上样量一般多少合适呢?还有上样体积?
3、检测的时候用 ...

裂解液的说明书上都有此种裂解液合适的细胞浓度,可以参考,蛋白上样量一般的 蛋白用0.75mm的板20μl就够了,第三个问题,我不知道,
2楼2011-01-13 15:17:32
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brilliantbug

木虫 (正式写手)


★ ★
xiajing_acm(金币+1):谢谢参与
novus(金币+1):谢谢交流! 2011-01-14 15:38:50
xiajing_acm(金币+2): 2011-04-07 21:12:59
xiajing_acm(金币+2): 2011-04-12 08:25:32
1 我们当时一般用6cm平皿做,6孔板的细胞数长满应该在100万左右,也可以做。只不过提取出来的蛋白浓度不一样。
2 上样前需要测蛋白浓度,一般用BCA法。然后保证每个泳道的总蛋白量一致,在30~80μg之间。也就是说每个孔加的蛋白溶液体积不一样。但要用PBS补加至每孔上样体积一致。上样体积跟个人技术也有关,新手建议控制在20μl以内,这就要求你蛋白浓度要大一点,所以最初用6cm平皿比较好。
3 显色与你使用的抗体也有关,显色后用凝胶呈现系统拍照,有的还需要做灰度分析。
建议你去碧云天网站上查看WESTERN相关试剂的说明书。
3楼2011-01-14 11:39:20
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gwf24634楼
2011-02-24 09:17   回复  
xiajing_acm(金币+1):谢谢参与
yk37825楼
2011-03-26 16:55   回复  
xiajing_acm(金币+1):谢谢参与
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