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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 药学 » 药理学 » 【求助】虚心向大家求教western blot
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xiajing_acm

新虫 (小有名气)

[交流] 【求助】虚心向大家求教western blot

各位大侠好！最近开始做western blot，我是新手，所以有些问题请教下大家：
1、从细胞中提蛋白时细胞数一般要达到多少啊？用6孔板长满细胞够吗？
2、蛋白上样量一般多少合适呢？还有上样体积？
3、检测的时候用DAB显色行吗？显色后是直接拍照还是用凝胶成像系统保存结果？
   用ECL怎样保存结果呢？
   新手，所以请各位大侠帮助下我！十分感谢！
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1楼 2010-11-30 18:08:58
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brilliantbug

木虫 (正式写手)
★ ★
xiajing_acm(金币+1):谢谢参与
novus(金币+1):谢谢交流！ 2011-01-14 15:38:50
xiajing_acm(金币+2): 2011-04-07 21:12:59
xiajing_acm(金币+2): 2011-04-12 08:25:32
1 我们当时一般用6cm平皿做，6孔板的细胞数长满应该在100万左右，也可以做。只不过提取出来的蛋白浓度不一样。
2 上样前需要测蛋白浓度，一般用BCA法。然后保证每个泳道的总蛋白量一致，在30~80μg之间。也就是说每个孔加的蛋白溶液体积不一样。但要用PBS补加至每孔上样体积一致。上样体积跟个人技术也有关，新手建议控制在20μl以内，这就要求你蛋白浓度要大一点，所以最初用6cm平皿比较好。
3 显色与你使用的抗体也有关，显色后用凝胶呈现系统拍照，有的还需要做灰度分析。
建议你去碧云天网站上查看WESTERN相关试剂的说明书。
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3楼2011-01-14 11:39:20
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huangwensh

木虫 (著名写手)
★ ★
xiajing_acm(金币+1):谢谢参与
qinhy(金币+1):多谢回帖交流，欢迎常来药学版！ 2011-01-13 19:16:49
引用回帖:
Originally posted by xiajing_acm at 2010-11-30 18:08:58:
各位大侠好！最近开始做western blot，我是新手，所以有些问题请教下大家：
1、从细胞中提蛋白时细胞数一般要达到多少啊？用6孔板长满细胞够吗？
2、蛋白上样量一般多少合适呢？还有上样体积？
3、检测的时候用 ...

裂解液的说明书上都有此种裂解液合适的细胞浓度，可以参考，蛋白上样量一般的 蛋白用0.75mm的板20μl就够了，第三个问题，我不知道，
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2楼2011-01-13 15:17:32
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