| 查看: 5684 | 回复: 7 | ||||
Hzhenping新虫 (小有名气)
|
[求助]
求助Western Blot实验条带没出现的原因分析及解决办法 已有4人参与
|
|
去年下半年做了一段时间WB实验，前田再次做，只换了个一抗和细胞裂解液，其他都没变（当然目的蛋白也不同了）。去年能出条带，这次却不能了。。。 现将改变的试剂及可疑操作罗列如下，供大神分析并搭救  1.细胞裂解液：RAPI细胞裂解液（强），碧云天生物技术研究所； 2.一抗:Isotype, IgG; Host, Rabbit; Species Reactivity, Human, Rat。 二抗：Goat Anti-Rabbit IgG. 3.目的蛋白大小约21KD，内参用GAPDH，于27KD-18KD处剪膜。一抗用5%BSA1:1500稀释，37oC孵育90min；二抗用5%BSA1:3000稀释,37oC孵育90min。 4.DAB显色试剂盒显色。PVDF膜的熊样如下：A 今天做了点蛋白试验（有叫“点杂交”），膜泡甲醇，晾干；蛋白样品（4个）按20ug/10ul加2xLoading Buffer煮沸后点于膜上,干后封闭，孵一抗，二抗，显色。PVDF膜熊样如下：B、C。（白斑之间即为蛋白点样点，由于膜被封闭液和5%BSA浸透而呈现这样）  A.jpg  B.jpg  C.jpg |
回复此楼» 收录本帖的淘帖专辑推荐
 蛋白质生物学实验经验 |
» 猜你喜欢
垃圾破二本职称评审标准
已经有19人回复
-
职称评审没过，求安慰
已经有53人回复
-
毕业后当辅导员了，天天各种学生超烦
已经有5人回复
-
26申博自荐
已经有3人回复
-
A期刊撤稿
已经有4人回复
» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- western blot出现多条带是什么原因
已经有8人回复
- western blot问题求助
已经有9人回复
- western-blot的问题！！！
已经有5人回复
- Western blot目的条带显影后怎么会这样？？？看图片
已经有8人回复
- 这个western blot 图是什么原因造成的？
已经有4人回复
- western blot实验求助
已经有5人回复
- Western Blot 目标条带跑不出来，内参条带清晰
已经有13人回复
- western blot中古怪的非特异性条带
已经有9人回复
- westernblot 目标蛋白无条带
已经有9人回复
- 求助western blot问题
已经有8人回复
- western blot 显色6组里边只有一组有条带，急，求助！谢谢！
已经有4人回复
- Western Blot出现问题
已经有19人回复
- western blot 第一次曝光有条带，而且浓厚，第二次就没有了。。。
已经有13人回复
- western-blot实验结果，大家帮忙分析下
已经有7人回复
- Western Blot实验的蛋白条带都连在一起
已经有37人回复
- 求助western blot
已经有5人回复
- western blot 求助，请高手指点一下
已经有8人回复
- western blot时marker问题求助
已经有18人回复
- 【求助/交流】western blot 缺带 断带
已经有21人回复
- 【求助/交流】western blot的内参总是不齐怎么办
已经有19人回复
- 【求助】虚心向大家求教western blot
已经有4人回复
- 【求助/交流】westernblot的背景怎么消除呀
已经有10人回复
- 【求助/交流】western blot 一直都跑不出来，不知道原因，大侠给分析一下啊！？
已经有13人回复
- 【求助/交流】请教Western blot出现非特异性条带的怎么解决
已经有8人回复
- 【求助/交流】western blot中的怪现象，求解~~~
已经有19人回复
- 【求助】western blot条带很淡是什么原因
已经有6人回复
Hzhenping2楼2014-07-10 07:48:19
Hzhenping
新虫 (小有名气)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 634.8
- 帖子: 66
- 在线: 18.8小时
- 虫号: 2238877
- 注册: 2013-01-13
- 性别: GG
- 专业: 药理学其他科学问题
3楼2014-07-10 09:13:16
liushuminlsm
新虫 (初入文坛)
- 应助: 2 (幼儿园)
- 金币: 65.4
- 红花: 2
- 帖子: 9
- 在线: 15.1小时
- 虫号: 1515706
- 注册: 2011-11-29
- 专业: 食品科学基础
4楼2014-07-11 11:26:57
Hzhenping
新虫 (小有名气)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 634.8
- 帖子: 66
- 在线: 18.8小时
- 虫号: 2238877
- 注册: 2013-01-13
- 性别: GG
- 专业: 药理学其他科学问题
5楼2014-07-11 19:59:32
凌波丽
专家顾问 (知名作家)
-
专家经验: +218 - BioEPI: 11
- 应助: 397 (硕士)
- 贵宾: 0.044
- 金币: 2118.9
- 散金: 10
- 红花: 208
- 帖子: 5633
- 在线: 571.6小时
- 虫号: 1766465
- 注册: 2012-04-19
- 性别: MM
- 专业: 生物大分子结构与功能
- 管辖: 生物科学综合
【答案】应助回帖
感谢参与，应助指数 +1
|
一、Western Blot实验条带没出现的原因分析及解决办法 ： 原因分析 解决办法 1.一抗和二抗失效 1. 更换抗体；选择现用现配的工作液 2.一抗和二抗不匹配 2. 更换为同种同属的同亚型的抗体底物 3.发光液失效 3. 更换新的发光液 4.抗体染色不充分 4. 增加抗体浓度；延长孵育时间 5.被测样品中不含有目的蛋白质或者目的 蛋白质含量太低 5. 设置阳性对照。确定标本中是否含有目的蛋白质； 增加样品 的上样量。 6. 溶液中有辣根过氧化物酶的抑制剂 6.用透析和超滤除去所用溶液中如叠氮化钠之类的抑制剂 7.抗体活力降低 7.在抗体活力保存时间内使用抗体；工作液现用现配 二、WB出现白斑是因为转膜过程有气泡存在；或者抗体的分布不均匀，孵育抗体时要使用摇床。 三、剪好的PVDF膜在使用前需要甲醇里泡1-2min，在零度的转膜液中孵育3-5min。 意见仅供参考。 |
6楼2014-07-11 23:54:30
凌波丽
专家顾问 (知名作家)
-
专家经验: +218 - BioEPI: 11
- 应助: 397 (硕士)
- 贵宾: 0.044
- 金币: 2118.9
- 散金: 10
- 红花: 208
- 帖子: 5633
- 在线: 571.6小时
- 虫号: 1766465
- 注册: 2012-04-19
- 性别: MM
- 专业: 生物大分子结构与功能
- 管辖: 生物科学综合
7楼2014-07-12 00:02:37
8楼2014-07-12 06:57:26