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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白电泳/WB » 求助Western Blot实验条带没出现的原因分析及解决办法
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Hzhenping

新虫 (小有名气)

[求助] 求助Western Blot实验条带没出现的原因分析及解决办法 已有4人参与

去年下半年做了一段时间WB实验，前田再次做，只换了个一抗和细胞裂解液，其他都没变（当然目的蛋白也不同了）。去年能出条带，这次却不能了。。。
现将改变的试剂及可疑操作罗列如下，供大神分析并搭救
1.细胞裂解液：RAPI细胞裂解液（强），碧云天生物技术研究所；
2.一抗:Isotype, IgG;    Host, Rabbit;     Species Reactivity, Human, Rat。  二抗：Goat Anti-Rabbit IgG.
3.目的蛋白大小约21KD，内参用GAPDH，于27KD-18KD处剪膜。一抗用5%BSA1:1500稀释，37oC孵育90min；二抗用5%BSA1:3000稀释,37oC孵育90min。
4.DAB显色试剂盒显色。PVDF膜的熊样如下：A

今天做了点蛋白试验（有叫“点杂交”），膜泡甲醇，晾干；蛋白样品（4个）按20ug/10ul加2xLoading Buffer煮沸后点于膜上,干后封闭，孵一抗，二抗，显色。PVDF膜熊样如下：B、C。（白斑之间即为蛋白点样点，由于膜被封闭液和5%BSA浸透而呈现这样）

求助Western Blot实验条带没出现的原因分析及解决办法
A.jpg


求助Western Blot实验条带没出现的原因分析及解决办法-1
B.jpg


求助Western Blot实验条带没出现的原因分析及解决办法-2
C.jpg
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1楼 2014-07-09 21:36:45
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nrahouston

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
目的条带是21kd，你剪膜27到18kD，这个风险太大了。
你是用的多大浓度的胶？很多时候预测的蛋白和实际跑出来的还是有差距的，而且和胶的浓度有关。
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8楼2014-07-12 06:57:26
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yzj926521

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
没有用预染marker呀，建议你再杂一下内参的抗体，一般内参的比较好用，如果能杂出内参条带的话就能证明膜没有转反。
要不然就是你的一抗不适用了
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Hzhenping
2楼2014-07-10 07:48:19
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Hzhenping

新虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by yzj926521 at 2014-07-10 07:48:19
没有用预染marker呀，建议你再杂一下内参的抗体，一般内参的比较好用，如果能杂出内参条带的话就能证明膜没有转反。
要不然就是你的一抗不适用了

前面的A膜有用marker,后面点蛋白实验B，C没用。我想问一下，我的一抗是新买的，N-term抗体，这跟二抗结合有影响吗？还有，从我的实验结果你能看出什么吗？

[ 发自小木虫客户端 ]
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3楼2014-07-10 09:13:16
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liushuminlsm

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
建议楼主注意一下转膜时间，还有这种小分子，转膜液中不要加入SDS。可以转膜的时候在下面压一张膜，看看有没有转过头，我之前一直做不出来，就是这个原因，我的蛋白是17kda
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Hzhenping
4楼2014-07-11 11:26:57
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