24小时热门版块排行榜    

北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
查看: 1646  |  回复: 8

袁1231

金虫 (小有名气)

[求助] 求助western blot问题

大家能帮我看下,这个是什么问题吗?western 新手。
前两张图,一张是SDS-PAGE 胶染色后,一张是转膜后western. 什么都看不出来。后两个都是western,背景很强,大家觉得我改怎么做? 已经是用10%的牛奶block了,难道我要换BSA试试?还是我一抗二抗的浓度加高了?谢谢大家。
求助western blot问题
2013-06-01_10-54-56_8bit.png


求助western blot问题-1
2013-06-01_13-08-28_8bit.png


求助western blot问题-2
2013-06-01_13-24-46_8bit.png


求助western blot问题-3
2013-06-01_13-51-50_8bit.png
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐,对您同样有帮助:

已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
袁1231: 金币+1 2013-06-04 02:33:49
wizardfan: 金币+2, 谢谢分析 2013-06-04 09:13:10
背景很深一般是二抗浓度太高或者洗膜不充分,但有时候也是因为一抗不是很好。你可以先试试增加二抗的稀释倍数,不行的话适当调整一抗的稀释倍数和上样量。
2楼2013-06-03 01:51:27
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

JinGang0317

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
袁1231: 金币+1 2013-06-04 02:31:27
wizardfan: 金币+1, 谢谢分享经验 2013-06-04 09:13:24
你第一张转膜的图片,让我想起自己之前做过一次实验,是海绵垫只放了一个,导致蛋白都跑过了,直接转移到转移缓冲液里了。你是不是也跟我犯了一样的错误??
静下心来、
3楼2013-06-03 07:35:07
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

袁1231

金虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by JinGang0317 at 2013-06-03 07:35:07
你第一张转膜的图片,让我想起自己之前做过一次实验,是海绵垫只放了一个,导致蛋白都跑过了,直接转移到转移缓冲液里了。你是不是也跟我犯了一样的错误??

不是,不过我的蛋白比较小,只有16, 21KD,难道真的转过了?我是350 mA, 1h。 要不我把所有抗体都strip了,用考马斯染一下吧。谢谢啊。
4楼2013-06-04 02:32:59
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

袁1231

金虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-06-03 01:51:27
背景很深一般是二抗浓度太高或者洗膜不充分,但有时候也是因为一抗不是很好。你可以先试试增加二抗的稀释倍数,不行的话适当调整一抗的稀释倍数和上样量。

我二抗是1:10000稀释的,用的pierce ECL试剂检测,貌似也不浓,我用的PVDF膜,看网上说nitrocellulose可能会好一些,你说我是不是要重跑呢?
5楼2013-06-04 02:35:10
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

袁1231

金虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-06-03 01:51:27
背景很深一般是二抗浓度太高或者洗膜不充分,但有时候也是因为一抗不是很好。你可以先试试增加二抗的稀释倍数,不行的话适当调整一抗的稀释倍数和上样量。

我一抗是先冲一遍,然后3*5min, 二抗是先冲一遍,然后3*10min. 据说洗脱了不好,我就担心是不是因为信号太弱了,所以背景就强了,就更不敢洗了。
6楼2013-06-04 02:38:41
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖


袁1231: 金币+1 2013-06-04 06:48:46
引用回帖:
6楼: Originally posted by 袁1231 at 2013-06-04 02:38:41
我一抗是先冲一遍,然后3*5min, 二抗是先冲一遍,然后3*10min. 据说洗脱了不好,我就担心是不是因为信号太弱了,所以背景就强了,就更不敢洗了。...

一般的洗膜不会洗过的,充分洗膜可以减少背景,尤其是对特异性差的抗体。我一般是一抗和二抗后分别洗5次。不同公司的二抗可能效价不同,即使有建议稀释倍数,还是要根据自己实验室的情况稍微优化一下。
7楼2013-06-04 05:00:36
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

袁1231

金虫 (小有名气)

引用回帖:
7楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-06-04 05:00:36
一般的洗膜不会洗过的,充分洗膜可以减少背景,尤其是对特异性差的抗体。我一般是一抗和二抗后分别洗5次。不同公司的二抗可能效价不同,即使有建议稀释倍数,还是要根据自己实验室的情况稍微优化一下。...

谢谢,你如果转膜对于大蛋白和小蛋白,你都用什么条件呢?别人告诉我350 mA 1hr, 可是不同蛋白大小是不是不一样啊?我一个150k, 一个16 k。 按这个条件,我发现ladder 都在的,但是今天发现我16k的那张膜上除了ladder,什么都没有,不知道是被我strip掉了还是就是没转上或者转过了。我一个strip了3次。另外PVDF和nitrocellulose是不是转膜也不一样呢?
8楼2013-06-04 06:52:22
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
袁1231: 金币+2 2013-06-05 10:59:19
引用回帖:
8楼: Originally posted by 袁1231 at 2013-06-04 06:52:22
谢谢,你如果转膜对于大蛋白和小蛋白,你都用什么条件呢?别人告诉我350 mA 1hr, 可是不同蛋白大小是不是不一样啊?我一个150k, 一个16 k。 按这个条件,我发现ladder 都在的,但是今天发现我16k的那张膜上除了lad ...

转膜和电泳的原理差不多,大蛋白跑得慢,小蛋白跑得快,所以转小蛋白所用的时间少一些,也可以适当降低电流。转膜的情况可以把胶染一下看看有没有残留。染膜当然也可以的,但染膜的反差比胶要差。如果用丽春红这样的染料,灵敏度不高,所以有时候看不到。我转NC膜用的条件与PVDF的一样,只是膜的性质不同,NC膜是亲水的,而且比较脆,操作的时候要小心一点。
9楼2013-06-04 11:00:48
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 袁1231 的主题更新
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 材料与化工371求调剂 +13 陪琳看海 2026-04-04 14/700 2026-04-06 00:58 by fmesaito
[考研] 086000生物与医药298调剂求助 +9 元元青青 2026-03-31 12/600 2026-04-05 21:03 by 学员8dgXkO
[考研] 生物与医药调剂 +4 十七sa 2026-04-05 4/200 2026-04-05 20:05 by lys0704
[考研] 材料专硕283求调剂 +14 试试看呗 2026-04-04 15/750 2026-04-05 19:21 by jkddd
[考研] 277求调剂 +5 考研调剂lxh 2026-04-05 5/250 2026-04-05 19:03 by chy09050039
[考研] 288求调剂 一志愿哈工大 材料与化工 +13 洛神哥哥 2026-04-03 13/650 2026-04-05 17:27 by zzx2138
[考研] 282求调剂 +3 aaa车辆 2026-04-01 3/150 2026-04-05 17:03 by yulian1987
[考研] 工科277分求调剂材料 +8 上了上了上哦 2026-04-05 9/450 2026-04-05 13:05 by wwytracy
[考研] 0703化学 +12 妮妮ninicgb 2026-04-04 13/650 2026-04-05 10:46 by 啊俊!
[考研] 272求调剂 +4 电气李 2026-04-05 4/200 2026-04-05 10:41 by lbsjt
[考研] 生物工程求调剂 +6 喜欢还是不甘心 2026-04-05 6/300 2026-04-05 10:28 by 唐沐儿
[考研] 可跨专业调剂 +3 周的得地 2026-04-04 6/300 2026-04-04 22:21 by barlinike
[考研] 材料调剂 +12 一样YWY 2026-04-02 13/650 2026-04-04 20:49 by 蓝云思雨
[考研] 本9一志愿2 0854低分专硕286求调剂 +9 芒种111 2026-04-04 9/450 2026-04-04 11:01 by tangruihua
[考研] 一志愿重庆大学085404,总分314分,求调剂 +4 zf83hn 2026-04-03 4/200 2026-04-03 21:25 by 啵啵啵0119
[考研] 考研调剂 +3 Draa 2026-04-03 3/150 2026-04-03 17:37 by hgwz7468
[硕博家园] 求老师收留 +9 lllq123 2026-04-03 9/450 2026-04-03 13:48 by 呼吸都是减肥
[考研] 312 化工或制药调剂 +8 小小墨123 2026-04-02 9/450 2026-04-03 09:12 by zhouxiaoyu
[考研] 26考研调剂 +4 Wnz.20030617 2026-04-01 5/250 2026-04-02 16:11 by 1939136013狗壮
[考研] 07生物学求调剂 一志愿同济大学359分 +3 LAMC. 2026-03-30 3/150 2026-04-02 10:26 by 18828373951
信息提示
请填处理意见