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袁1231

金虫 (小有名气)

[求助] 求助western blot问题

大家能帮我看下,这个是什么问题吗?western 新手。
前两张图,一张是SDS-PAGE 胶染色后,一张是转膜后western. 什么都看不出来。后两个都是western,背景很强,大家觉得我改怎么做? 已经是用10%的牛奶block了,难道我要换BSA试试?还是我一抗二抗的浓度加高了?谢谢大家。
求助western blot问题
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求助western blot问题-1
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求助western blot问题-2
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求助western blot问题-3
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
袁1231: 金币+1 2013-06-04 02:33:49
wizardfan: 金币+2, 谢谢分析 2013-06-04 09:13:10
背景很深一般是二抗浓度太高或者洗膜不充分,但有时候也是因为一抗不是很好。你可以先试试增加二抗的稀释倍数,不行的话适当调整一抗的稀释倍数和上样量。
2楼2013-06-03 01:51:27
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JinGang0317

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
袁1231: 金币+1 2013-06-04 02:31:27
wizardfan: 金币+1, 谢谢分享经验 2013-06-04 09:13:24
你第一张转膜的图片,让我想起自己之前做过一次实验,是海绵垫只放了一个,导致蛋白都跑过了,直接转移到转移缓冲液里了。你是不是也跟我犯了一样的错误??
静下心来、
3楼2013-06-03 07:35:07
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袁1231

金虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by JinGang0317 at 2013-06-03 07:35:07
你第一张转膜的图片,让我想起自己之前做过一次实验,是海绵垫只放了一个,导致蛋白都跑过了,直接转移到转移缓冲液里了。你是不是也跟我犯了一样的错误??

不是,不过我的蛋白比较小,只有16, 21KD,难道真的转过了?我是350 mA, 1h。 要不我把所有抗体都strip了,用考马斯染一下吧。谢谢啊。
4楼2013-06-04 02:32:59
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袁1231

金虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-06-03 01:51:27
背景很深一般是二抗浓度太高或者洗膜不充分,但有时候也是因为一抗不是很好。你可以先试试增加二抗的稀释倍数,不行的话适当调整一抗的稀释倍数和上样量。

我二抗是1:10000稀释的,用的pierce ECL试剂检测,貌似也不浓,我用的PVDF膜,看网上说nitrocellulose可能会好一些,你说我是不是要重跑呢?
5楼2013-06-04 02:35:10
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袁1231

金虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-06-03 01:51:27
背景很深一般是二抗浓度太高或者洗膜不充分,但有时候也是因为一抗不是很好。你可以先试试增加二抗的稀释倍数,不行的话适当调整一抗的稀释倍数和上样量。

我一抗是先冲一遍,然后3*5min, 二抗是先冲一遍,然后3*10min. 据说洗脱了不好,我就担心是不是因为信号太弱了,所以背景就强了,就更不敢洗了。
6楼2013-06-04 02:38:41
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖


袁1231: 金币+1 2013-06-04 06:48:46
引用回帖:
6楼: Originally posted by 袁1231 at 2013-06-04 02:38:41
我一抗是先冲一遍,然后3*5min, 二抗是先冲一遍,然后3*10min. 据说洗脱了不好,我就担心是不是因为信号太弱了,所以背景就强了,就更不敢洗了。...

一般的洗膜不会洗过的,充分洗膜可以减少背景,尤其是对特异性差的抗体。我一般是一抗和二抗后分别洗5次。不同公司的二抗可能效价不同,即使有建议稀释倍数,还是要根据自己实验室的情况稍微优化一下。
7楼2013-06-04 05:00:36
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袁1231

金虫 (小有名气)

引用回帖:
7楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-06-04 05:00:36
一般的洗膜不会洗过的,充分洗膜可以减少背景,尤其是对特异性差的抗体。我一般是一抗和二抗后分别洗5次。不同公司的二抗可能效价不同,即使有建议稀释倍数,还是要根据自己实验室的情况稍微优化一下。...

谢谢,你如果转膜对于大蛋白和小蛋白,你都用什么条件呢?别人告诉我350 mA 1hr, 可是不同蛋白大小是不是不一样啊?我一个150k, 一个16 k。 按这个条件,我发现ladder 都在的,但是今天发现我16k的那张膜上除了ladder,什么都没有,不知道是被我strip掉了还是就是没转上或者转过了。我一个strip了3次。另外PVDF和nitrocellulose是不是转膜也不一样呢?
8楼2013-06-04 06:52:22
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
袁1231: 金币+2 2013-06-05 10:59:19
引用回帖:
8楼: Originally posted by 袁1231 at 2013-06-04 06:52:22
谢谢,你如果转膜对于大蛋白和小蛋白,你都用什么条件呢?别人告诉我350 mA 1hr, 可是不同蛋白大小是不是不一样啊?我一个150k, 一个16 k。 按这个条件,我发现ladder 都在的,但是今天发现我16k的那张膜上除了lad ...

转膜和电泳的原理差不多,大蛋白跑得慢,小蛋白跑得快,所以转小蛋白所用的时间少一些,也可以适当降低电流。转膜的情况可以把胶染一下看看有没有残留。染膜当然也可以的,但染膜的反差比胶要差。如果用丽春红这样的染料,灵敏度不高,所以有时候看不到。我转NC膜用的条件与PVDF的一样,只是膜的性质不同,NC膜是亲水的,而且比较脆,操作的时候要小心一点。
9楼2013-06-04 11:00:48
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