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袁1231

金虫 (小有名气)

[求助] 求助western blot问题

大家能帮我看下，这个是什么问题吗？western 新手。
前两张图，一张是SDS-PAGE 胶染色后，一张是转膜后western. 什么都看不出来。后两个都是western，背景很强，大家觉得我改怎么做？ 已经是用10%的牛奶block了，难道我要换BSA试试？还是我一抗二抗的浓度加高了？谢谢大家。
求助western blot问题
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求助western blot问题-1
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求助western blot问题-2
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求助western blot问题-3
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1楼2013-06-02 06:26:54
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
袁1231: 金币+1 2013-06-04 02:33:49
wizardfan: 金币+2, 谢谢分析 2013-06-04 09:13:10
背景很深一般是二抗浓度太高或者洗膜不充分，但有时候也是因为一抗不是很好。你可以先试试增加二抗的稀释倍数，不行的话适当调整一抗的稀释倍数和上样量。
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2楼2013-06-03 01:51:27
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JinGang0317

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
袁1231: 金币+1 2013-06-04 02:31:27
wizardfan: 金币+1, 谢谢分享经验 2013-06-04 09:13:24
你第一张转膜的图片，让我想起自己之前做过一次实验，是海绵垫只放了一个，导致蛋白都跑过了，直接转移到转移缓冲液里了。你是不是也跟我犯了一样的错误？？
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静下心来、
3楼2013-06-03 07:35:07
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袁1231

金虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by JinGang0317 at 2013-06-03 07:35:07
你第一张转膜的图片，让我想起自己之前做过一次实验，是海绵垫只放了一个，导致蛋白都跑过了，直接转移到转移缓冲液里了。你是不是也跟我犯了一样的错误？？

不是，不过我的蛋白比较小，只有16， 21KD，难道真的转过了？我是350 mA, 1h。 要不我把所有抗体都strip了，用考马斯染一下吧。谢谢啊。
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4楼2013-06-04 02:32:59
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袁1231

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-06-03 01:51:27
背景很深一般是二抗浓度太高或者洗膜不充分，但有时候也是因为一抗不是很好。你可以先试试增加二抗的稀释倍数，不行的话适当调整一抗的稀释倍数和上样量。

我二抗是1:10000稀释的，用的pierce ECL试剂检测，貌似也不浓，我用的PVDF膜，看网上说nitrocellulose可能会好一些，你说我是不是要重跑呢？
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5楼2013-06-04 02:35:10
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袁1231

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-06-03 01:51:27
背景很深一般是二抗浓度太高或者洗膜不充分，但有时候也是因为一抗不是很好。你可以先试试增加二抗的稀释倍数，不行的话适当调整一抗的稀释倍数和上样量。

我一抗是先冲一遍，然后3*5min， 二抗是先冲一遍，然后3*10min. 据说洗脱了不好，我就担心是不是因为信号太弱了，所以背景就强了，就更不敢洗了。
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6楼2013-06-04 02:38:41
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
袁1231: 金币+1 2013-06-04 06:48:46
引用回帖:
6楼: Originally posted by 袁1231 at 2013-06-04 02:38:41
我一抗是先冲一遍，然后3*5min， 二抗是先冲一遍，然后3*10min. 据说洗脱了不好，我就担心是不是因为信号太弱了，所以背景就强了，就更不敢洗了。...

一般的洗膜不会洗过的，充分洗膜可以减少背景，尤其是对特异性差的抗体。我一般是一抗和二抗后分别洗5次。不同公司的二抗可能效价不同，即使有建议稀释倍数，还是要根据自己实验室的情况稍微优化一下。
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7楼2013-06-04 05:00:36
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袁1231

金虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-06-04 05:00:36
一般的洗膜不会洗过的，充分洗膜可以减少背景，尤其是对特异性差的抗体。我一般是一抗和二抗后分别洗5次。不同公司的二抗可能效价不同，即使有建议稀释倍数，还是要根据自己实验室的情况稍微优化一下。...

谢谢，你如果转膜对于大蛋白和小蛋白，你都用什么条件呢？别人告诉我350 mA 1hr, 可是不同蛋白大小是不是不一样啊？我一个150k, 一个16 k。 按这个条件，我发现ladder 都在的，但是今天发现我16k的那张膜上除了ladder，什么都没有，不知道是被我strip掉了还是就是没转上或者转过了。我一个strip了3次。另外PVDF和nitrocellulose是不是转膜也不一样呢？
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8楼2013-06-04 06:52:22
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
袁1231: 金币+2 2013-06-05 10:59:19
引用回帖:
8楼: Originally posted by 袁1231 at 2013-06-04 06:52:22
谢谢，你如果转膜对于大蛋白和小蛋白，你都用什么条件呢？别人告诉我350 mA 1hr, 可是不同蛋白大小是不是不一样啊？我一个150k, 一个16 k。 按这个条件，我发现ladder 都在的，但是今天发现我16k的那张膜上除了lad ...

转膜和电泳的原理差不多，大蛋白跑得慢，小蛋白跑得快，所以转小蛋白所用的时间少一些，也可以适当降低电流。转膜的情况可以把胶染一下看看有没有残留。染膜当然也可以的，但染膜的反差比胶要差。如果用丽春红这样的染料，灵敏度不高，所以有时候看不到。我转NC膜用的条件与PVDF的一样，只是膜的性质不同，NC膜是亲水的，而且比较脆，操作的时候要小心一点。
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9楼2013-06-04 11:00:48
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