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袁1231

金虫 (小有名气)

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[求助] 求助western blot问题

大家能帮我看下，这个是什么问题吗？western 新手。
前两张图，一张是SDS-PAGE 胶染色后，一张是转膜后western. 什么都看不出来。后两个都是western，背景很强，大家觉得我改怎么做？已经是用10%的牛奶block了，难道我要换BSA试试？还是我一抗二抗的浓度加高了？谢谢大家。

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1楼2013-06-02 06:26:54

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袁1231

金虫 (小有名气)

应助: 6 (幼儿园)
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专业: 生物医用高分子材料

引用回帖:

7楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-06-04 05:00:36
一般的洗膜不会洗过的，充分洗膜可以减少背景，尤其是对特异性差的抗体。我一般是一抗和二抗后分别洗5次。不同公司的二抗可能效价不同，即使有建议稀释倍数，还是要根据自己实验室的情况稍微优化一下。...

谢谢，你如果转膜对于大蛋白和小蛋白，你都用什么条件呢？别人告诉我350 mA 1hr, 可是不同蛋白大小是不是不一样啊？我一个150k, 一个16 k。按这个条件，我发现ladder 都在的，但是今天发现我16k的那张膜上除了ladder，什么都没有，不知道是被我strip掉了还是就是没转上或者转过了。我一个strip了3次。另外PVDF和nitrocellulose是不是转膜也不一样呢？