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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » western blot中古怪的非特异性条带
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糖泡泡

金虫 (正式写手)

[求助] western blot中古怪的非特异性条带

最近做western blot总受一些非特异性条带的干扰，虽查了好多资料，一一排查，还是没有解决。想问下我的蛋白经过反应后是溶解在酸性溶液里（pH 4.0-6.0）,直接加入loading buffer煮沸后电泳转膜显色，酸性溶液中的蛋白直接western blot会是非特异性显色的来源吗？大家还有什么好的建议针对我的非特异性。
Ps，发现从背面看我的特异性条带特别明显，非特异性条带不怎么清楚。但正面看膜的话特异性条带模糊，非特异性条带特别浓，这又是什么原因？
Help!

[ Last edited by 1949stone on 2013-7-5 at 15:59 ]
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1楼2013-06-28 18:57:24
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kx444555

至尊木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, Gifts of roses, hand there are lingering fragrance. Look forward to your wonderful and more detailed answer. 2013-06-28 20:47:54
糖泡泡: 金币+3 2013-07-05 14:07:40
正面背面的问题，难道你的转膜有穿孔现象？可以换张另一批次的PVDF膜再做次看看，
杂带问题一般说来，先稀释样品，做个梯度，如果还有杂带，稀释一抗，做梯度，试试如何，再不行，投诉抗体公司，不是你的错
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星陈代谢
2楼2013-06-28 19:39:56
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
糖泡泡: 金币+3 2013-07-05 14:09:30
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-07-05 14:51:24
western中的非特异条带是一抗的原因吧。抗体的特异性不好才会识别其它蛋白。你的抗体是自己做的吗？可以试试纯化一下抗体。
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3楼2013-06-29 08:32:20
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糖泡泡

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by kx444555 at 2013-06-28 19:39:56
正面背面的问题，难道你的转膜有穿孔现象？可以换张另一批次的PVDF膜再做次看看，
杂带问题一般说来，先稀释样品，做个梯度，如果还有杂带，稀释一抗，做梯度，试试如何，再不行，投诉抗体公司，不是你的错

我的非特异性显色的条带比我特异性显色的条带还要明显，只是从背面看的话就相反，而且实验结果不能很好地重复，有时候成功了，没有非特异性条带，有时候就悲剧了，关键是大部分都是悲剧的还有什么好的建议吗？非常感谢！
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4楼2013-07-05 14:09:17
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糖泡泡

金虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-06-29 08:32:20
western中的非特异条带是一抗的原因吧。抗体的特异性不好才会识别其它蛋白。你的抗体是自己做的吗？可以试试纯化一下抗体。

抗体是买的，其实我做的很简单，就是HRP-亲和素孵育，我的蛋白是带生物素标签的，关键是实验有时候做的出来，有时候又做不出来！郁闷！
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5楼2013-07-05 14:11:42
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
糖泡泡: 金币+3 2013-07-05 17:07:07
引用回帖:
5楼: Originally posted by 糖泡泡 at 2013-07-05 14:11:42
抗体是买的，其实我做的很简单，就是HRP-亲和素孵育，我的蛋白是带生物素标签的，关键是实验有时候做的出来，有时候又做不出来！郁闷！...

有可能与上样量和转膜效果有关。你是否做了上样量及抗体稀释倍数的优化？
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6楼2013-07-05 15:54:57
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糖泡泡

金虫 (正式写手)
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6楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-07-05 15:54:57
有可能与上样量和转膜效果有关。你是否做了上样量及抗体稀释倍数的优化？...

非特异性蛋白对应ＳＤＳ－ＰＡＧＥ条带很浅，但是ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ条带却很深。我自个应该特异性显色的蛋白其实烤染挺深的，但是转到膜上就很浅，倒是反过来看背面很深，这是为什么呀？还没做过上样量的优化，准备按照你的建议试一下
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7楼2013-07-05 17:09:16
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
糖泡泡: 金币+3 2013-07-06 10:45:02
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7楼: Originally posted by 糖泡泡 at 2013-07-05 17:09:16
非特异性蛋白对应ＳＤＳ－ＰＡＧＥ条带很浅，但是ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ条带却很深。我自个应该特异性显色的蛋白其实烤染挺深的，但是转到膜上就很浅，倒是反过来看背面很深，这是为什么呀？还没做过上样量的优化 ...

你的意思是说转完膜后你做了染色，发现目的蛋白条带浅？你是否也染了转完膜的胶？你的目的蛋白多大，用的膜的孔径是多少？会不会是转膜条件不合适转过了或者没有转完全？
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8楼2013-07-06 00:40:49
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糖泡泡

金虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-07-06 00:40:49
你的意思是说转完膜后你做了染色，发现目的蛋白条带浅？你是否也染了转完膜的胶？你的目的蛋白多大，用的膜的孔径是多少？会不会是转膜条件不合适转过了或者没有转完全？...

谢谢你的建议！我没有用丽春红染NC膜，就是将样品上了两份，一份跑后的胶用考马斯亮蓝染色，观察上样量，一份直接western。我的目标蛋白是45 k，是经过多种修饰的。非特异性的蛋白是39 K。现在遇到的情况是非特异性蛋白上样量很少，western条带还很深，而我的目标条带相反。理论上我的目的条带比那个非特异性条带要大，更不容易转过，但目的条带在背面看显色更深，正面很浅。应该是转完全了，染过转完膜后的胶，没有东西。
可以跟您在QQ上聊吗？有一些westernblot的问题想请教下，不知道可不可以知道你ＱＱ，非常感谢！
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9楼2013-07-06 10:50:51
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
9楼: Originally posted by 糖泡泡 at 2013-07-06 10:50:51
谢谢你的建议！我没有用丽春红染NC膜，就是将样品上了两份，一份跑后的胶用考马斯亮蓝染色，观察上样量，一份直接western。我的目标蛋白是45 k，是经过多种修饰的。非特异性的蛋白是39 K。现在遇到的情况是非特异性 ...

我没有遇到过这种情况。因为western是半定量的，应该是蛋白量越多条带越深。不知道你做western的目的是什么，既然目标蛋白和非特异条带在胶上位置不同，应该可以区分，这种结果也算是可以接受的吧。我几乎不用QQ的。你可以发email给我：cicelyzhang@hotmail.com
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10楼2013-07-06 13:42:57
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