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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助 western blot 分离胶处残留条带
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zrtpaopao

金虫 (小有名气)

[求助] 求助 western blot 分离胶处残留条带

western blot实验 胶跑完后在浓缩胶处能看到一排明显的白色条带，继续转膜用丽春红染色也能染出条带但是没有以前的颜色深。我怀疑是不是胶上的蛋白没有完全跑下去剩了一部分在分离胶上？

求正解！！！
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1楼 2012-09-26 17:50:46
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
zrtpaopao: 金币+1, ★★★很有帮助 2012-09-26 19:35:21
是没完全跑下去的蛋白，是不是上样量偏大或是膜蛋白
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jiayoubashaonian
2楼2012-09-26 18:53:20
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zrtpaopao

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by blackrose8089 at 2012-09-26 18:53:20
是没完全跑下去的蛋白，是不是上样量偏大或是膜蛋白

每次上样量都是一样的，只是做这么长时间WB以来出现过两次这样的情况，所以是不是可以排除这两个原因。但是我把胶用考马斯亮蓝染色确实是蛋白。
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3楼2012-09-26 19:34:17
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zrtpaopao

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by blackrose8089 at 2012-09-26 18:53:20
是没完全跑下去的蛋白，是不是上样量偏大或是膜蛋白

再弱弱的问一下 膜蛋白会跑不下去吗？
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4楼2012-09-26 19:36:19
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)
丁香园一位同学的解释，供参考：
“样品没有进入分离胶的原因
样品处理不好，蛋白部分发生凝集，分子量变大造成；蛋白浓度过大，堵住胶孔了；蛋白本身分子量就不适合采用这种方法。
制胶不好，尿素浓度，制胶温度，方法都很重要。温度降低，尿素浓度过大的话，由于溶解度降低，会从胶液中析出。尿素浓度过高，胶虽然凝了，但尿素没有完全均匀溶解在其中，局部过高，堵塞胶孔。”
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zrtpaopao
jiayoubashaonian
5楼2012-09-26 21:14:28
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
一般是大的疏水性蛋白或者样品未完全变性的蛋白。这种情况很难完全避免，尤其是上样量较大时可以看得比较清楚。如果你做银染就能更明显的看到。只要占总样品的比例不大就是正常现象。做Western后证明的目的蛋白不在其中的话就更没什么好担心的了。
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zrtpaopao
6楼2012-09-27 07:42:27
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zrtpaopao

金虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
6楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-09-27 07:42:27
一般是大的疏水性蛋白或者样品未完全变性的蛋白。这种情况很难完全避免，尤其是上样量较大时可以看得比较清楚。如果你做银染就能更明显的看到。只要占总样品的比例不大就是正常现象。做Western后证明的目的蛋白不在 ...

你说的对，只要WB能做出想要的结果，剩下的都是浮云。但是综其原因 我觉得很可能是我制胶的问题，因为我每次都是一下处理好多组样品混到一起 用的时候随机组合出一组样品上样。
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7楼2012-09-27 09:25:43
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zrtpaopao

金虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
5楼: Originally posted by blackrose8089 at 2012-09-26 21:14:28
丁香园一位同学的解释，供参考：
“样品没有进入分离胶的原因
样品处理不好，蛋白部分发生凝集，分子量变大造成；蛋白浓度过大，堵住胶孔了；蛋白本身分子量就不适合采用这种方法。
制胶不好，尿素浓度，制胶温度 ...

综合这些原因 我觉得很可能是我制胶的问题，因为我每次都是一下处理好多组样品混到一起 用的时候随机组合出一组样品上样。再有可能就是上样之前我吧样品离心了一下 是不是离心的不对？一般都离心多长时间 多大转速？
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8楼2012-09-27 09:33:18
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
8楼: Originally posted by zrtpaopao at 2012-09-27 09:33:18
综合这些原因 我觉得很可能是我制胶的问题，因为我每次都是一下处理好多组样品混到一起 用的时候随机组合出一组样品上样。再有可能就是上样之前我吧样品离心了一下 是不是离心的不对？一般都离心多长时间 多大转速 ...

我们是12000rpm，15min
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jiayoubashaonian
9楼2012-09-27 10:12:04
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