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zrtpaopao

金虫 (小有名气)

[求助] 求助 western blot 分离胶处残留条带

western blot实验 胶跑完后在浓缩胶处能看到一排明显的白色条带,继续转膜用丽春红染色也能染出条带但是没有以前的颜色深。我怀疑是不是胶上的蛋白没有完全跑下去剩了一部分在分离胶上?

求正解!!!
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
zrtpaopao: 金币+1, ★★★很有帮助 2012-09-26 19:35:21
是没完全跑下去的蛋白,是不是上样量偏大或是膜蛋白
jiayoubashaonian
2楼2012-09-26 18:53:20
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zrtpaopao

金虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by blackrose8089 at 2012-09-26 18:53:20
是没完全跑下去的蛋白,是不是上样量偏大或是膜蛋白

每次上样量都是一样的,只是做这么长时间WB以来出现过两次这样的情况,所以是不是可以排除这两个原因。但是我把胶用考马斯亮蓝染色确实是蛋白。
3楼2012-09-26 19:34:17
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zrtpaopao

金虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by blackrose8089 at 2012-09-26 18:53:20
是没完全跑下去的蛋白,是不是上样量偏大或是膜蛋白

再弱弱的问一下 膜蛋白会跑不下去吗?
4楼2012-09-26 19:36:19
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)

丁香园一位同学的解释,供参考:
“样品没有进入分离胶的原因
样品处理不好,蛋白部分发生凝集,分子量变大造成;蛋白浓度过大,堵住胶孔了;蛋白本身分子量就不适合采用这种方法。
制胶不好,尿素浓度,制胶温度,方法都很重要。温度降低,尿素浓度过大的话,由于溶解度降低,会从胶液中析出。尿素浓度过高,胶虽然凝了,但尿素没有完全均匀溶解在其中,局部过高,堵塞胶孔。”

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jiayoubashaonian
5楼2012-09-26 21:14:28
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

一般是大的疏水性蛋白或者样品未完全变性的蛋白。这种情况很难完全避免,尤其是上样量较大时可以看得比较清楚。如果你做银染就能更明显的看到。只要占总样品的比例不大就是正常现象。做Western后证明的目的蛋白不在其中的话就更没什么好担心的了。

» 本帖已获得的红花(最新10朵)

6楼2012-09-27 07:42:27
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zrtpaopao

金虫 (小有名气)

送鲜花一朵
引用回帖:
6楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-09-27 07:42:27
一般是大的疏水性蛋白或者样品未完全变性的蛋白。这种情况很难完全避免,尤其是上样量较大时可以看得比较清楚。如果你做银染就能更明显的看到。只要占总样品的比例不大就是正常现象。做Western后证明的目的蛋白不在 ...

你说的对,只要WB能做出想要的结果,剩下的都是浮云。但是综其原因 我觉得很可能是我制胶的问题,因为我每次都是一下处理好多组样品混到一起 用的时候随机组合出一组样品上样。
7楼2012-09-27 09:25:43
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zrtpaopao

金虫 (小有名气)

送鲜花一朵
引用回帖:
5楼: Originally posted by blackrose8089 at 2012-09-26 21:14:28
丁香园一位同学的解释,供参考:
“样品没有进入分离胶的原因
样品处理不好,蛋白部分发生凝集,分子量变大造成;蛋白浓度过大,堵住胶孔了;蛋白本身分子量就不适合采用这种方法。
制胶不好,尿素浓度,制胶温度 ...

综合这些原因 我觉得很可能是我制胶的问题,因为我每次都是一下处理好多组样品混到一起 用的时候随机组合出一组样品上样。再有可能就是上样之前我吧样品离心了一下 是不是离心的不对?一般都离心多长时间 多大转速?
8楼2012-09-27 09:33:18
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)

引用回帖:
8楼: Originally posted by zrtpaopao at 2012-09-27 09:33:18
综合这些原因 我觉得很可能是我制胶的问题,因为我每次都是一下处理好多组样品混到一起 用的时候随机组合出一组样品上样。再有可能就是上样之前我吧样品离心了一下 是不是离心的不对?一般都离心多长时间 多大转速 ...

我们是12000rpm,15min
jiayoubashaonian
9楼2012-09-27 10:12:04
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