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xiaomch2011

新虫 (初入文坛)

[交流] western blot 的蛋白上样量 已有6人参与

我是新手,没做过western,看资料western的蛋白上样量是30-100微克,有这么多吗??蛋白电泳考染也是1-2微克就可以了??western听说会上少一点,这样搞到我糊涂了,究竟上多少微升的蛋白??

[ Last edited by xiaomch2011 on 2013-6-26 at 11:59 ]
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

一般上50ug左右的量
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
2楼2013-06-26 12:27:09
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gaojuan1985

新虫 (正式写手)

★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
myprayer: 金币+1, Gifts of roses, hand there are lingering fragrance. Look forward to your wonderful and more detailed answer. 2013-06-26 14:26:11
50 ug?不能一概而论吧
还是要取决于样品,是细胞裂解液还是单一蛋白?单一蛋白的话几个微克就足够,如果是细胞裂解液的话可以上的多一些,10-20 ug
3楼2013-06-26 12:47:37
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xiaomch2011

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by gaojuan1985 at 2013-06-26 12:47:37
50 ug?不能一概而论吧
还是要取决于样品,是细胞裂解液还是单一蛋白?单一蛋白的话几个微克就足够,如果是细胞裂解液的话可以上的多一些,10-20 ug

我的蛋白是单一蛋白,浓度0.62mg/ml,我跑电泳考染是上3ul,那么western也上3ul??这样子会不会太多了??
4楼2013-06-26 13:08:01
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
myprayer: 金币+1, Gifts of roses, hand there are lingering fragrance. Look forward to your wonderful and more detailed answer. 2013-06-26 14:26:22
引用回帖:
4楼: Originally posted by xiaomch2011 at 2013-06-26 13:08:01
我的蛋白是单一蛋白,浓度0.62mg/ml,我跑电泳考染是上3ul,那么western也上3ul??这样子会不会太多了??...

30-100μg蛋白是指未经纯化的总蛋白提取物的量。如果你用的是纯品,western的上样量可以很小。western的检出限比考染和银染都低,一般只要有ng级,甚至几十pg的蛋白就可以检测到。当然,这还要看你使用的抗体的效价如何。我觉得你可以把考染是上样量降低100-1000倍试试。
5楼2013-06-26 14:15:28
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xiaomch2011

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
5楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-06-26 14:15:28
30-100μg蛋白是指未经纯化的总蛋白提取物的量。如果你用的是纯品,western的上样量可以很小。western的检出限比考染和银染都低,一般只要有ng级,甚至几十pg的蛋白就可以检测到。当然,这还要看你使用的抗体的效价 ...

我明白了,谢谢!!
6楼2013-06-26 14:27:43
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sc5921041

木虫 (著名写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
if your antibody is not so good or the protein level in the cell is quite low , the loading amount can be up to 500ug.
nostalgia
7楼2013-06-27 09:53:58
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昙花巫婆

银虫 (小有名气)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
你得先做一下预实验,因为western很不稳定,会有很多因素影响,上样量要根据你的实验的目的来定。还有你抗体的敏感性和特异性。希望对你实验有帮助!
我是女博士,但我并不可怕!
8楼2013-11-04 21:23:21
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LZLLZLLZL

木虫 (小有名气)

10-20微克
9楼2014-04-16 20:03:32
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