| 查看: 3131 | 回复: 5 | |||
sxxuan金虫 (著名写手)
|
[求助]
超声破碎后跑胶有拖尾，是蛋白降解还是？
|
||
|
用的是重组菌，载体是pET28a，宿主菌是BL21,37℃诱导6h后收集菌体，以1/10体积的PBS或超声buffer重悬菌体，1.5ml的EP管加入1ml悬液，超声破碎，条件是工作1s停1s，连续1min后冰浴1min，然后重复一次，超声是在冰水浴中进行的。12000rpm离心10min后跑核酸电泳，结果如第一张图发现有拖尾，有些条带看起来很虚很模糊，第二次就增加了25℃低温诱导过夜，只超声了1次没有重复，还是差不多，这是什么原因？是超声不够还是超声条件有问题？可以如何避免或改善？ ps：我的目的蛋白很大，所以用核酸电泳检测也没问题的，如果用SDS-PAGE检测的话只能检测到单体。 另外就是同样的培养条件和超声条件，但结果好像会有差异（如第三张图），原因可能是什么？  图片1.jpg  图片2.jpg  图片3.jpg |
回复此楼» 收录本帖的淘帖专辑推荐
 分子生化实验经验积累 |
» 猜你喜欢
不合理蛙科研实验中的趣事：实验器材的 “乌龙”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验中的趣事：和实验材料的 “斗智斗勇”
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有82人回复
-
蛋白质检测：精准分析，解锁生物分子的密码
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之小鼠实验：严谨设计，解析生命机制的重要载体
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之重金属检测：精准筛查，守护健康与环境的防线
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“蛙测重金属我背锅三千”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“鼠逃三次我发三篇SCI”
已经有0人回复
-
纳米粒度分析
已经有3人回复
-
林科院林化所招收材料与化工专业硕士，坐标南京
已经有0人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 超声破碎细胞之后 离心转速问题
已经有15人回复
- 蛋白诱导不能表达！
已经有21人回复
- 胞内酶不能用超声破碎怎么办？
已经有15人回复
- 蛋白包涵体透析后杂蛋白很多，请教原因
已经有10人回复
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
sxxuan: 金币+5, ★★★很有帮助, 整个流程都说得很清楚，谢谢 2013-02-04 11:48:18
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-04-27 17:02:41
gyesang: 回帖置顶 2013-04-27 17:02:47
感谢参与，应助指数 +1
sxxuan: 金币+5, ★★★很有帮助, 整个流程都说得很清楚，谢谢 2013-02-04 11:48:18
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-04-27 17:02:41
gyesang: 回帖置顶 2013-04-27 17:02:47
|
我师姐做这个超声波破碎的，我把她拉过来问了她，她说： 1）破碎完之后 就是蛋白的混合物，你要纯化（目的蛋白上带个标签比如GST、HIS，过柱子纯化）后再做PAGE。 2）你的图1和2是琼脂糖胶 然后紫外拍照 是吧，好像流程不是这么做的。一般超声破碎完 蛋白PAGE胶->考马斯亮蓝染色，看看蛋白 是否表达，如果表达：超声破碎完的蛋白 纯化->PAGE胶->考马斯亮蓝染色，如果蛋白表达量低不足以 到染色的最小敏感值，那就增加上样量，无效的话再转膜做WB（不过你说你的蛋白很大 不影响，这个我不懂 就不做评论了） 3）你的目的蛋白 是多聚体吗？你查一下各个单体之间的作用力是什么，四级结构相互作用需要非共价键，包括：疏水键(SDS可破坏)、盐键、范德华力、二硫键（被loading buffer中巯基乙醇或DTT破坏）。根据你的蛋白非共价键 在配置上样buffer和胶的时候注意 放什么不放什么，或许就能检测到 多聚体了 |
2楼2013-02-01 13:16:25
sxxuan
金虫 (著名写手)
- MolEPI: 4
- 应助: 107 (高中生)
- 金币: 3442.4
- 散金: 104
- 红花: 17
- 帖子: 1478
- 在线: 266.1小时
- 虫号: 512865
- 注册: 2008-02-27
- 性别: MM
- 专业: 生物化学
3楼2013-02-04 11:47:39
yongbo_liang
新虫 (小有名气)
- MolEPI: 1
- 应助: 43 (小学生)
- 金币: 266.2
- 散金: 10
- 帖子: 114
- 在线: 52.5小时
- 虫号: 2009557
- 注册: 2012-09-18
- 专业: 生物大分子结构与功能
豆豆52734楼2013-02-04 14:20:41
sxxuan
金虫 (著名写手)
- MolEPI: 4
- 应助: 107 (高中生)
- 金币: 3442.4
- 散金: 104
- 红花: 17
- 帖子: 1478
- 在线: 266.1小时
- 虫号: 512865
- 注册: 2008-02-27
- 性别: MM
- 专业: 生物化学
5楼2013-02-04 14:27:45
6楼2013-03-29 21:24:13
