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sxxuan金虫 (著名写手)
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超声破碎后跑胶有拖尾，是蛋白降解还是？
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用的是重组菌，载体是pET28a，宿主菌是BL21,37℃诱导6h后收集菌体，以1/10体积的PBS或超声buffer重悬菌体，1.5ml的EP管加入1ml悬液，超声破碎，条件是工作1s停1s，连续1min后冰浴1min，然后重复一次，超声是在冰水浴中进行的。12000rpm离心10min后跑核酸电泳，结果如第一张图发现有拖尾，有些条带看起来很虚很模糊，第二次就增加了25℃低温诱导过夜，只超声了1次没有重复，还是差不多，这是什么原因？是超声不够还是超声条件有问题？可以如何避免或改善？ ps：我的目的蛋白很大，所以用核酸电泳检测也没问题的，如果用SDS-PAGE检测的话只能检测到单体。 另外就是同样的培养条件和超声条件，但结果好像会有差异（如第三张图），原因可能是什么？  图片1.jpg  图片2.jpg  图片3.jpg |
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yongbo_liang
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豆豆52734楼2013-02-04 14:20:41
【答案】应助回帖
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我师姐做这个超声波破碎的，我把她拉过来问了她，她说： 1）破碎完之后 就是蛋白的混合物，你要纯化（目的蛋白上带个标签比如GST、HIS，过柱子纯化）后再做PAGE。 2）你的图1和2是琼脂糖胶 然后紫外拍照 是吧，好像流程不是这么做的。一般超声破碎完 蛋白PAGE胶->考马斯亮蓝染色，看看蛋白 是否表达，如果表达：超声破碎完的蛋白 纯化->PAGE胶->考马斯亮蓝染色，如果蛋白表达量低不足以 到染色的最小敏感值，那就增加上样量，无效的话再转膜做WB（不过你说你的蛋白很大 不影响，这个我不懂 就不做评论了） 3）你的目的蛋白 是多聚体吗？你查一下各个单体之间的作用力是什么，四级结构相互作用需要非共价键，包括：疏水键(SDS可破坏)、盐键、范德华力、二硫键（被loading buffer中巯基乙醇或DTT破坏）。根据你的蛋白非共价键 在配置上样buffer和胶的时候注意 放什么不放什么，或许就能检测到 多聚体了 |
2楼2013-02-01 13:16:25
sxxuan
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3楼2013-02-04 11:47:39
sxxuan
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