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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 超声破碎后跑胶有拖尾，是蛋白降解还是？
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sxxuan

金虫 (著名写手)

[求助] 超声破碎后跑胶有拖尾，是蛋白降解还是？

用的是重组菌，载体是pET28a，宿主菌是BL21,37℃诱导6h后收集菌体，以1/10体积的PBS或超声buffer重悬菌体，1.5ml的EP管加入1ml悬液，超声破碎，条件是工作1s停1s，连续1min后冰浴1min，然后重复一次，超声是在冰水浴中进行的。12000rpm离心10min后跑核酸电泳，结果如第一张图发现有拖尾，有些条带看起来很虚很模糊，第二次就增加了25℃低温诱导过夜，只超声了1次没有重复，还是差不多，这是什么原因？是超声不够还是超声条件有问题？可以如何避免或改善？
ps：我的目的蛋白很大，所以用核酸电泳检测也没问题的，如果用SDS-PAGE检测的话只能检测到单体。
另外就是同样的培养条件和超声条件，但结果好像会有差异（如第三张图），原因可能是什么？

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1楼 2013-01-31 15:17:05
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豆豆5273

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
sxxuan: 金币+5, ★★★很有帮助, 整个流程都说得很清楚，谢谢 2013-02-04 11:48:18
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-04-27 17:02:41
gyesang: 回帖置顶 2013-04-27 17:02:47
我师姐做这个超声波破碎的，我把她拉过来问了她，她说：
1）破碎完之后 就是蛋白的混合物，你要纯化（目的蛋白上带个标签比如GST、HIS，过柱子纯化）后再做PAGE。
2）你的图1和2是琼脂糖胶 然后紫外拍照 是吧，好像流程不是这么做的。一般超声破碎完 蛋白PAGE胶->考马斯亮蓝染色，看看蛋白 是否表达，如果表达：超声破碎完的蛋白 纯化->PAGE胶->考马斯亮蓝染色，如果蛋白表达量低不足以 到染色的最小敏感值，那就增加上样量，无效的话再转膜做WB（不过你说你的蛋白很大 不影响，这个我不懂 就不做评论了）
3）你的目的蛋白 是多聚体吗？你查一下各个单体之间的作用力是什么，四级结构相互作用需要非共价键，包括：疏水键(SDS可破坏)、盐键、范德华力、二硫键（被loading buffer中巯基乙醇或DTT破坏）。根据你的蛋白非共价键 在配置上样buffer和胶的时候注意 放什么不放什么，或许就能检测到 多聚体了
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选择生物并为之努力
2楼2013-02-01 13:16:25
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sxxuan

金虫 (著名写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 豆豆5273 at 2013-02-01 13:16:25
我师姐做这个超声波破碎的，我把她拉过来问了她，她说：
1）破碎完之后 就是蛋白的混合物，你要纯化（目的蛋白上带个标签比如GST、HIS，过柱子纯化）后再做PAGE。
2）你的图1和2是琼脂糖胶 然后紫外拍照 是吧，好 ...

谢谢您这么详细的回答
1. 我的蛋白是多聚体，有2500kD那么大。我看文献都是直接跑琼脂糖胶的，所以也有样学样。由于实在太大，所以用普通的PAGE也难以检测，本来想跑非变性的，但老大说跑核酸电泳就可以，so~
2. 载体不带标签，我尝试用分子筛纯化，效果也不是特别好。因为我希望把残留的质粒去除干净，但总会有残留，而且出现好几个峰。所以希望看看是不是超声条件有问题，把蛋白降解了，或者是表达的时候过度包装或者包装不够
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3楼2013-02-04 11:47:39
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yongbo_liang

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
sxxuan: 金币+45, ★有帮助 2013-02-04 14:27:50
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-05-31 14:05:51
电泳时的托尾现象和你样品有很大关系
1.样品太浓了
2.样品中含有溶解性不好的东西，你可以把加完上样BUFFER的样品离心后，再电泳就会好了。
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豆豆5273
4楼2013-02-04 14:20:41
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sxxuan

金虫 (著名写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by yongbo_liang at 2013-02-04 14:20:41
电泳时的托尾现象和你样品有很大关系
1.样品太浓了
2.样品中含有溶解性不好的东西，你可以把加完上样BUFFER的样品离心后，再电泳就会好了。

好的，谢谢你，我会试一下
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5楼2013-02-04 14:27:45
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豆豆5273

金虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
4楼: Originally posted by yongbo_liang at 2013-02-04 14:20:41
电泳时的托尾现象和你样品有很大关系
1.样品太浓了
2.样品中含有溶解性不好的东西，你可以把加完上样BUFFER的样品离心后，再电泳就会好了。

你好 请问你回复这位楼主的 “加完上样BUFFER的样品离心后电泳”我有点看不懂，你能解释一下吗，我看楼主本来 也有离心12000rpm离心10min 呀
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选择生物并为之努力
6楼2013-03-29 21:24:13
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