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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 胞内酶不能用超声破碎怎么办？
北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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ss000qq

金虫 (正式写手)

[求助] 胞内酶不能用超声破碎怎么办？

大家好：
       最近做实验遇到一个问题，就是我重组的蛋白属于胞内酶，但最近诱导破碎菌体再跑SDS-PAGE蛋白胶发现，没有目的蛋白，而用诱导后的菌液直接上样的则有目的条带，难道我这个酶太容易变性？破碎完一经离心，变性的蛋白随之沉底，而留下上样的上清则没有东西？
       我用的是T7表达载体，不知道和这种现象有没有关联？不知大家有没有遇到过这种情况啊？急求解答！谢谢
       备注：破碎条件我采用的是P=50%，破2秒，停5秒，总时间1分钟时拿出冷却。还有一点是我的蛋白的诱导表达量不是很高，因为还未经诱导条件的优化。使用IPTG诱导的，宿舍菌为BL21.
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1楼 2012-02-29 19:46:04
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

whb21

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
建议你做些对照试验，诱导后菌液离心上清和沉淀分别跑一下胶，看看是否蛋白全在沉淀中，如果那样的话就比较麻烦，还得进行包涵体变性复性...
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3楼2012-03-01 09:53:10
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whb21

木虫 (著名写手)
★
西瓜: 金币+1, 鼓励交流 2012-04-01 17:25:07
引用回帖:
3楼: Originally posted by whb21 at 2012-03-01 09:53:10:
建议你做些对照试验，诱导后菌液离心上清和沉淀分别跑一下胶，看看是否蛋白全在沉淀中，如果那样的话就比较麻烦，还得进行包涵体变性复性...

工程菌表达外源蛋白是很容易形成包涵体的，由于强启动子表达外源蛋白的速度太快了，使得蛋白不能很好的折叠导致包涵体的形成。我以前做蛋白改造也出现这问题，很不好弄，你可以试试降低诱导温度，祝好运！
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11楼2012-03-02 10:01:20
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linsaijun

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
很可能是形成包涵体了。
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NopainNoGain!
2楼2012-02-29 21:25:05
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dingke_s

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木(金币+2): 鼓励应助 2012-03-01 17:11:48
ss000qq(金币+2): ★★★很有帮助 谢谢 2012-03-01 17:16:18
形成包涵体的情况应该是比较常见的，一般来说是由于表达量太高，或者诱导过快，蛋白不能正确折叠，导致不可溶，细菌破碎后都在沉淀里面了。建议您先参考一下减少包涵体形成的方法：比如在诱导时间，IPTG浓度，诱导转速等方面做梯度探索，或者破碎前液氮速冻一下，使细胞破裂更完全等。具体的办法您参考一些表达纯化的文献。做包涵体变性，复性还是比较麻烦的。如果能改变诱导条件，增加蛋白可溶，就可以进行下一步的实验。
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6楼2012-03-01 16:31:20
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若水5886

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+3, Good！ 2012-04-01 17:25:55
给你想个找出问题的办法：
诱导后的菌液分成下面几份上样跑胶：第1份 直接离心取培养基上清 第2份 取超声破碎的沉淀 第3份 取超声破碎的上清  

都上样看看哪些里面有目的蛋白，看看是你的蛋白形成包涵体了还是由于处理处理过程造成蛋白的变性或者是降解。蛋白超声的时候除了注意温度要保持在低温还要注意加入蛋白酶抑制剂以防止蛋白讲解。
形成包涵体一般是由于表达条件不合适，包括温度，诱导剂浓度等，使得蛋白没有正确折叠。
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10楼2012-03-02 09:28:21
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ss000qq

金虫 (正式写手)
引用回帖:
楼: Originally posted by 若水5886 at 2012-03-02 09:28:21:
给你想个找出问题的办法：
诱导后的菌液分成下面几份上样跑胶：第1份 直接离心取培养基上清 第2份 取超声破碎的沉淀 第3份 取超声破碎的上清  

都上样看看哪些里面有目的蛋白，看看是你的蛋白形成包涵体了还是 ...

谢谢，不过我的表达量很低呢，条带不是很明显，包涵体是不是应该不会形成啊？不是说表达量过高过快才容易形成包涵体的嘛？我还没有做诱导条件的优化，现在只是诱导温度28℃，IPTG终浓度0.6mM/L。你说的那三步我今天尝试了，结果还没出来。呵呵
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13楼2012-03-04 20:11:43
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ganchao1776

至尊木虫 (职业作家)
★
小丹木木(金币+1): 鼓励交流 2012-03-05 10:58:59
包涵体的形成主要有两个原因：1.与蛋白有关，这个基上很难解决的，只能从分子改造上象办法；2与表达速度有关，这个可以从很多方面上改变，比如诱导温度，摇床转速，培养基营养，诱导剂浓度上着手。
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14楼2012-03-04 21:46:59
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AnaSequence

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+2, 鼓励交流 2012-04-01 17:26:18
ss000qq: 金币+1, ★有帮助, 谢谢 2012-04-06 15:34:02
引用回帖:
13楼: Originally posted by ss000qq at 2012-03-04 20:11:43:
谢谢，不过我的表达量很低呢，条带不是很明显，包涵体是不是应该不会形成啊？不是说表达量过高过快才容易形成包涵体的嘛？我还没有做诱导条件的优化，现在只是诱导温度28℃，IPTG终浓度0.6mM/L。你说的那三步我今 ...

你把破胞离心得到的沉淀按照包涵体的处理方式处理了，再跑SDS-PAGE看，就知道表达是高还是低了，形成包涵体后，所表达的蛋白基本都在包涵体了，你还没把包涵体怎么样，只看上情，当然看不到高表达的蛋白条带了。
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15楼2012-04-01 08:26:32
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普通回帖

ss000qq

金虫 (正式写手)
引用回帖:
楼: Originally posted by whb21 at 2012-03-01 09:53:10:
建议你做些对照试验，诱导后菌液离心上清和沉淀分别跑一下胶，看看是否蛋白全在沉淀中，如果那样的话就比较麻烦，还得进行包涵体变性复性...

请问在我做的这个试验中为什么会形成包涵体啊？是哪个环节造成的啊？谢谢
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4楼2012-03-01 13:57:05
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ss000qq

金虫 (正式写手)
引用回帖:
楼: Originally posted by linsaijun at 2012-02-29 21:25:05:
很可能是形成包涵体了。

请问在我这个试验中哪个环节导致形成了包涵体啊？以前没接触过包涵体的情况。谢谢
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5楼2012-03-01 13:59:39
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ss000qq

金虫 (正式写手)
引用回帖:
楼: Originally posted by dingke_s at 2012-03-01 16:31:20:
形成包涵体的情况应该是比较常见的，一般来说是由于表达量太高，或者诱导过快，蛋白不能正确折叠，导致不可溶，细菌破碎后都在沉淀里面了。建议您先参考一下减少包涵体形成的方法：比如在诱导时间，IPTG浓度，诱导 ...

好的，谢谢哈
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7楼2012-03-01 17:15:48
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547star

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
才1分钟,太短了,试试5分钟-10分钟看看.
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为什么
8楼2012-03-01 20:51:12
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ss000qq

金虫 (正式写手)
引用回帖:
楼: Originally posted by 547star at 2012-03-01 20:51:12:
才1分钟,太短了,试试5分钟-10分钟看看.

不是，我是总时间1分钟时拿出来冷却，防止继续破下去产热太多导致酶失活，凉上一会再继续破碎的。总破碎时间约6,7分钟。
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9楼2012-03-02 09:07:48
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