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胞内酶不能用超声破碎怎么办？
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大家好： 最近做实验遇到一个问题，就是我重组的蛋白属于胞内酶，但最近诱导破碎菌体再跑SDS-PAGE蛋白胶发现，没有目的蛋白，而用诱导后的菌液直接上样的则有目的条带，难道我这个酶太容易变性？破碎完一经离心，变性的蛋白随之沉底，而留下上样的上清则没有东西？ 我用的是T7表达载体，不知道和这种现象有没有关联？不知大家有没有遇到过这种情况啊？急求解答！谢谢 备注：破碎条件我采用的是P=50%，破2秒，停5秒，总时间1分钟时拿出冷却。还有一点是我的蛋白的诱导表达量不是很高，因为还未经诱导条件的优化。使用IPTG诱导的，宿舍菌为BL21. |
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3楼2012-03-01 09:53:10
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11楼2012-03-02 10:01:20
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| 形成包涵体的情况应该是比较常见的，一般来说是由于表达量太高，或者诱导过快，蛋白不能正确折叠，导致不可溶，细菌破碎后都在沉淀里面了。建议您先参考一下减少包涵体形成的方法：比如在诱导时间，IPTG浓度，诱导转速等方面做梯度探索，或者破碎前液氮速冻一下，使细胞破裂更完全等。具体的办法您参考一些表达纯化的文献。做包涵体变性，复性还是比较麻烦的。如果能改变诱导条件，增加蛋白可溶，就可以进行下一步的实验。 |
6楼2012-03-01 16:31:20
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