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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 胞内酶不能用超声破碎怎么办？
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whb21

木虫 (著名写手)
★
西瓜: 金币+1, 鼓励交流 2012-04-01 17:25:07
引用回帖:
3楼: Originally posted by whb21 at 2012-03-01 09:53:10:
建议你做些对照试验，诱导后菌液离心上清和沉淀分别跑一下胶，看看是否蛋白全在沉淀中，如果那样的话就比较麻烦，还得进行包涵体变性复性...

工程菌表达外源蛋白是很容易形成包涵体的，由于强启动子表达外源蛋白的速度太快了，使得蛋白不能很好的折叠导致包涵体的形成。我以前做蛋白改造也出现这问题，很不好弄，你可以试试降低诱导温度，祝好运！
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11楼2012-03-02 10:01:20
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ss000qq

金虫 (正式写手)
引用回帖:
楼: Originally posted by whb21 at 2012-03-02 10:01:20:
工程菌表达外源蛋白是很容易形成包涵体的，由于强启动子表达外源蛋白的速度太快了，使得蛋白不能很好的折叠导致包涵体的形成。我以前做蛋白改造也出现这问题，很不好弄，你可以试试降低诱导温度，祝好运！

恩，谢谢
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12楼2012-03-04 20:02:47
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ss000qq

金虫 (正式写手)
引用回帖:
楼: Originally posted by 若水5886 at 2012-03-02 09:28:21:
给你想个找出问题的办法：
诱导后的菌液分成下面几份上样跑胶：第1份 直接离心取培养基上清 第2份 取超声破碎的沉淀 第3份 取超声破碎的上清  

都上样看看哪些里面有目的蛋白，看看是你的蛋白形成包涵体了还是 ...

谢谢，不过我的表达量很低呢，条带不是很明显，包涵体是不是应该不会形成啊？不是说表达量过高过快才容易形成包涵体的嘛？我还没有做诱导条件的优化，现在只是诱导温度28℃，IPTG终浓度0.6mM/L。你说的那三步我今天尝试了，结果还没出来。呵呵
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13楼2012-03-04 20:11:43
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ganchao1776

至尊木虫 (职业作家)
★
小丹木木(金币+1): 鼓励交流 2012-03-05 10:58:59
包涵体的形成主要有两个原因：1.与蛋白有关，这个基上很难解决的，只能从分子改造上象办法；2与表达速度有关，这个可以从很多方面上改变，比如诱导温度，摇床转速，培养基营养，诱导剂浓度上着手。
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14楼2012-03-04 21:46:59
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AnaSequence

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+2, 鼓励交流 2012-04-01 17:26:18
ss000qq: 金币+1, ★有帮助, 谢谢 2012-04-06 15:34:02
引用回帖:
13楼: Originally posted by ss000qq at 2012-03-04 20:11:43:
谢谢，不过我的表达量很低呢，条带不是很明显，包涵体是不是应该不会形成啊？不是说表达量过高过快才容易形成包涵体的嘛？我还没有做诱导条件的优化，现在只是诱导温度28℃，IPTG终浓度0.6mM/L。你说的那三步我今 ...

你把破胞离心得到的沉淀按照包涵体的处理方式处理了，再跑SDS-PAGE看，就知道表达是高还是低了，形成包涵体后，所表达的蛋白基本都在包涵体了，你还没把包涵体怎么样，只看上情，当然看不到高表达的蛋白条带了。
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15楼2012-04-01 08:26:32
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ss000qq

金虫 (正式写手)
引用回帖:
15楼: Originally posted by AnaSequence at 2012-04-01 08:26:32:
你把破胞离心得到的沉淀按照包涵体的处理方式处理了，再跑SDS-PAGE看，就知道表达是高还是低了，形成包涵体后，所表达的蛋白基本都在包涵体了，你还没把包涵体怎么样，只看上情，当然看不到高表达的蛋白条带了。

谢谢，那个沉淀我用包涵体变性再复性的方法做了，确定是包涵体，但是复性效果不大，没有活力。电泳显示目的蛋白很纯。
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16楼2012-04-06 09:08:07
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