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sxxuan

金虫 (著名写手)

[求助] 超声破碎后跑胶有拖尾,是蛋白降解还是?

用的是重组菌,载体是pET28a,宿主菌是BL21,37℃诱导6h后收集菌体,以1/10体积的PBS或超声buffer重悬菌体,1.5ml的EP管加入1ml悬液,超声破碎,条件是工作1s停1s,连续1min后冰浴1min,然后重复一次,超声是在冰水浴中进行的。12000rpm离心10min后跑核酸电泳,结果如第一张图发现有拖尾,有些条带看起来很虚很模糊,第二次就增加了25℃低温诱导过夜,只超声了1次没有重复,还是差不多,这是什么原因?是超声不够还是超声条件有问题?可以如何避免或改善?
ps:我的目的蛋白很大,所以用核酸电泳检测也没问题的,如果用SDS-PAGE检测的话只能检测到单体。
另外就是同样的培养条件和超声条件,但结果好像会有差异(如第三张图),原因可能是什么?

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你的日子如何,你的力量也必如何!
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豆豆5273

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
sxxuan: 金币+5, ★★★很有帮助, 整个流程都说得很清楚,谢谢 2013-02-04 11:48:18
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助! 2013-04-27 17:02:41
gyesang: 回帖置顶 2013-04-27 17:02:47
我师姐做这个超声波破碎的,我把她拉过来问了她,她说:
1)破碎完之后 就是蛋白的混合物,你要纯化(目的蛋白上带个标签比如GST、HIS,过柱子纯化)后再做PAGE。
2)你的图1和2是琼脂糖胶 然后紫外拍照 是吧,好像流程不是这么做的。一般超声破碎完 蛋白PAGE胶->考马斯亮蓝染色,看看蛋白 是否表达,如果表达:超声破碎完的蛋白 纯化->PAGE胶->考马斯亮蓝染色,如果蛋白表达量低不足以 到染色的最小敏感值,那就增加上样量,无效的话再转膜做WB(不过你说你的蛋白很大 不影响,这个我不懂 就不做评论了)
3)你的目的蛋白 是多聚体吗?你查一下各个单体之间的作用力是什么,四级结构相互作用需要非共价键,包括:疏水键(SDS可破坏)、盐键、范德华力、二硫键(被loading buffer中巯基乙醇或DTT破坏)。根据你的蛋白非共价键 在配置上样buffer和胶的时候注意 放什么不放什么,或许就能检测到 多聚体了
选择生物并为之努力
2楼2013-02-01 13:16:25
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sxxuan

金虫 (著名写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 豆豆5273 at 2013-02-01 13:16:25
我师姐做这个超声波破碎的,我把她拉过来问了她,她说:
1)破碎完之后 就是蛋白的混合物,你要纯化(目的蛋白上带个标签比如GST、HIS,过柱子纯化)后再做PAGE。
2)你的图1和2是琼脂糖胶 然后紫外拍照 是吧,好 ...

谢谢您这么详细的回答
1. 我的蛋白是多聚体,有2500kD那么大。我看文献都是直接跑琼脂糖胶的,所以也有样学样。由于实在太大,所以用普通的PAGE也难以检测,本来想跑非变性的,但老大说跑核酸电泳就可以,so~
2. 载体不带标签,我尝试用分子筛纯化,效果也不是特别好。因为我希望把残留的质粒去除干净,但总会有残留,而且出现好几个峰。所以希望看看是不是超声条件有问题,把蛋白降解了,或者是表达的时候过度包装或者包装不够
你的日子如何,你的力量也必如何!
3楼2013-02-04 11:47:39
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yongbo_liang

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
sxxuan: 金币+45, 有帮助 2013-02-04 14:27:50
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助! 2013-05-31 14:05:51
电泳时的托尾现象和你样品有很大关系
1.样品太浓了
2.样品中含有溶解性不好的东西,你可以把加完上样BUFFER的样品离心后,再电泳就会好了。

» 本帖已获得的红花(最新10朵)

4楼2013-02-04 14:20:41
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sxxuan

金虫 (著名写手)

引用回帖:
4楼: Originally posted by yongbo_liang at 2013-02-04 14:20:41
电泳时的托尾现象和你样品有很大关系
1.样品太浓了
2.样品中含有溶解性不好的东西,你可以把加完上样BUFFER的样品离心后,再电泳就会好了。

好的,谢谢你,我会试一下
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5楼2013-02-04 14:27:45
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豆豆5273

金虫 (小有名气)

送鲜花一朵
引用回帖:
4楼: Originally posted by yongbo_liang at 2013-02-04 14:20:41
电泳时的托尾现象和你样品有很大关系
1.样品太浓了
2.样品中含有溶解性不好的东西,你可以把加完上样BUFFER的样品离心后,再电泳就会好了。

你好 请问你回复这位楼主的 “加完上样BUFFER的样品离心后电泳”我有点看不懂,你能解释一下吗,我看楼主本来 也有离心12000rpm离心10min 呀
选择生物并为之努力
6楼2013-03-29 21:24:13
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