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noah1020

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
silicare(金币+2, BioEPI+1): 谢谢参与 2011-08-19 15:13:52
我用CST抗体做过p-erk~很好用的抗体~我用的药物刺激后peak出现在5min~你要真给药48h估计悬了...还是缩短暴露时间试试吧~还有就是,抗体可以在-20存,蛋白必须在-80,尤其是磷酸化的!在转膜的时候在转膜槽外面加一个盆,放满冰,让转膜槽处于冰浴的状态~你提取蛋白的方法是什么?提取要是不注意的话,磷酸化蛋白很脆弱,会讲解的~我当时提取的时候用的是Roche公司的提取试剂盒,比较可靠~WB就是这样,如果你的蛋白很稳定很给力,拿做起来就会相当顺手;如果蛋白不是很牢靠的话,就会比较麻烦了~
11楼2011-08-19 14:58:17
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geek23

木虫 (小有名气)

引用回帖:
11楼: Originally posted by noah1020 at 2011-08-19 14:58:17:
我用CST抗体做过p-erk~很好用的抗体~我用的药物刺激后peak出现在5min~你要真给药48h估计悬了...还是缩短暴露时间试试吧~还有就是,抗体可以在-20存,蛋白必须在-80,尤其是磷酸化的!在转膜的时候在转膜槽外面加一 ...

谢谢你的经验分享. 我主要做肝癌细胞. 而且检测过很多种磷酸化蛋白.前几次有检测出表达变化,比如p-cdc25c, p-cjun.用的是RIPA法裂解蛋白, PI 用的是罗氏的,加了磷酸酶抑制剂的.估计这几次的实验结果还是和蛋白的质量有关. 我还想问问你. 磷酸化蛋白检测,你一般上样量多少啊?
Bethechangeyouwishtosee.
12楼2011-08-19 15:03:42
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noah1020

新虫 (小有名气)

★ ★
lstt09nk(金币+2): 感谢参与 2011-08-19 18:12:27
引用回帖:
12楼: Originally posted by geek23 at 2011-08-19 15:03:42:
谢谢你的经验分享. 我主要做肝癌细胞. 而且检测过很多种磷酸化蛋白.前几次有检测出表达变化,比如p-cdc25c, p-cjun.用的是RIPA法裂解蛋白, PI 用的是罗氏的,加了磷酸酶抑制剂的.估计这几次的实验结果还是和蛋白的 ...

我的上样量大,因为我用的是原代细胞~大概一个泳道上60ug的蛋白~按理说肝癌细胞比较皮实的,一般情况下癌症细胞内的蛋白会比较给力,也不那么脆弱~你再试试~
13楼2011-08-19 15:13:41
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geek23

木虫 (小有名气)

引用回帖:
13楼: Originally posted by noah1020 at 2011-08-19 15:13:41:
我的上样量大,因为我用的是原代细胞~大概一个泳道上60ug的蛋白~按理说肝癌细胞比较皮实的,一般情况下癌症细胞内的蛋白会比较给力,也不那么脆弱~你再试试~

嗯嗯  谢谢 下次多注意一下 有问题再请教
Bethechangeyouwishtosee.
14楼2011-08-19 15:18:59
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wenjiji85

新虫 (初入文坛)

我觉得磷酸化蛋白检测和总蛋白不差太多,不过有几点要注意:
1、磷酸化过程比较快,时间点确实不要太晚
2、提蛋白一定加蛋白酶抑制剂
3、封闭液不能用脱脂牛奶,得用BSA
4、蛋白最好不要冻融,冻融后磷酸化蛋白降解严重
5、有时候磷酸化蛋白是很弱,可以考虑用更强的ECL显色液试试。
15楼2011-11-13 15:18:30
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wenjiji85

新虫 (初入文坛)

呃,是磷脂酶抑制剂,打错了
16楼2011-11-13 15:19:53
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linyingjia

至尊木虫 (职业作家)

和普通的抗体一样     量产的一般只能检测特定位点的     自己找的可能不行
17楼2011-11-13 22:26:54
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蓝天_1988

金虫 (小有名气)

封闭过夜,一抗时间长些。
18楼2011-11-17 15:36:59
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bluecompass

新虫 (初入文坛)

提取蛋白的时候做好加入磷酸酶抑制剂如氟化钠,钒酸钠等
19楼2011-11-19 20:33:07
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zplipeng

金虫 (著名写手)

引用回帖:
15楼: Originally posted by wenjiji85 at 2011-11-13 15:18:30:
我觉得磷酸化蛋白检测和总蛋白不差太多,不过有几点要注意:
1、磷酸化过程比较快,时间点确实不要太晚
2、提蛋白一定加蛋白酶抑制剂
3、封闭液不能用脱脂牛奶,得用BSA
4、蛋白最好不要冻融,冻融后磷酸化蛋 ...

请问封闭液为什么不能用脱脂牛奶呢?
加油哦↖(^ω^)↗,O(∩_∩)O哈哈~
20楼2011-12-12 19:52:52
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