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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » WB检测磷酸化蛋白
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noah1020

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
silicare(金币+2, BioEPI+1): 谢谢参与 2011-08-19 15:13:52
我用CST抗体做过p-erk~很好用的抗体~我用的药物刺激后peak出现在5min~你要真给药48h估计悬了...还是缩短暴露时间试试吧~还有就是，抗体可以在-20存，蛋白必须在-80，尤其是磷酸化的！在转膜的时候在转膜槽外面加一个盆，放满冰，让转膜槽处于冰浴的状态~你提取蛋白的方法是什么？提取要是不注意的话，磷酸化蛋白很脆弱，会讲解的~我当时提取的时候用的是Roche公司的提取试剂盒，比较可靠~WB就是这样，如果你的蛋白很稳定很给力，拿做起来就会相当顺手；如果蛋白不是很牢靠的话，就会比较麻烦了~
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11楼2011-08-19 14:58:17
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geek23

木虫 (小有名气)
引用回帖:
11楼: Originally posted by noah1020 at 2011-08-19 14:58:17:
我用CST抗体做过p-erk~很好用的抗体~我用的药物刺激后peak出现在5min~你要真给药48h估计悬了...还是缩短暴露时间试试吧~还有就是，抗体可以在-20存，蛋白必须在-80，尤其是磷酸化的！在转膜的时候在转膜槽外面加一 ...

谢谢你的经验分享. 我主要做肝癌细胞. 而且检测过很多种磷酸化蛋白.前几次有检测出表达变化,比如p-cdc25c, p-cjun.用的是RIPA法裂解蛋白, PI 用的是罗氏的,加了磷酸酶抑制剂的.估计这几次的实验结果还是和蛋白的质量有关. 我还想问问你. 磷酸化蛋白检测,你一般上样量多少啊?
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Bethechangeyouwishtosee.
12楼2011-08-19 15:03:42
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noah1020

新虫 (小有名气)
★ ★
lstt09nk(金币+2): 感谢参与 2011-08-19 18:12:27
引用回帖:
12楼: Originally posted by geek23 at 2011-08-19 15:03:42:
谢谢你的经验分享. 我主要做肝癌细胞. 而且检测过很多种磷酸化蛋白.前几次有检测出表达变化,比如p-cdc25c, p-cjun.用的是RIPA法裂解蛋白, PI 用的是罗氏的,加了磷酸酶抑制剂的.估计这几次的实验结果还是和蛋白的 ...

我的上样量大，因为我用的是原代细胞~大概一个泳道上60ug的蛋白~按理说肝癌细胞比较皮实的，一般情况下癌症细胞内的蛋白会比较给力，也不那么脆弱~你再试试~
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13楼2011-08-19 15:13:41
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geek23

木虫 (小有名气)
引用回帖:
13楼: Originally posted by noah1020 at 2011-08-19 15:13:41:
我的上样量大，因为我用的是原代细胞~大概一个泳道上60ug的蛋白~按理说肝癌细胞比较皮实的，一般情况下癌症细胞内的蛋白会比较给力，也不那么脆弱~你再试试~

嗯嗯  谢谢 下次多注意一下 有问题再请教
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Bethechangeyouwishtosee.
14楼2011-08-19 15:18:59
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wenjiji85

新虫 (初入文坛)
我觉得磷酸化蛋白检测和总蛋白不差太多，不过有几点要注意：
1、磷酸化过程比较快，时间点确实不要太晚
2、提蛋白一定加蛋白酶抑制剂
3、封闭液不能用脱脂牛奶，得用BSA
4、蛋白最好不要冻融，冻融后磷酸化蛋白降解严重
5、有时候磷酸化蛋白是很弱，可以考虑用更强的ECL显色液试试。
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15楼2011-11-13 15:18:30
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wenjiji85

新虫 (初入文坛)
呃，是磷脂酶抑制剂，打错了
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16楼2011-11-13 15:19:53
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linyingjia

至尊木虫 (职业作家)
和普通的抗体一样     量产的一般只能检测特定位点的     自己找的可能不行
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17楼2011-11-13 22:26:54
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蓝天_1988

金虫 (小有名气)
封闭过夜，一抗时间长些。
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18楼2011-11-17 15:36:59
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bluecompass

新虫 (初入文坛)
提取蛋白的时候做好加入磷酸酶抑制剂如氟化钠，钒酸钠等
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19楼2011-11-19 20:33:07
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zplipeng

金虫 (著名写手)
引用回帖:
15楼: Originally posted by wenjiji85 at 2011-11-13 15:18:30:
我觉得磷酸化蛋白检测和总蛋白不差太多，不过有几点要注意：
1、磷酸化过程比较快，时间点确实不要太晚
2、提蛋白一定加蛋白酶抑制剂
3、封闭液不能用脱脂牛奶，得用BSA
4、蛋白最好不要冻融，冻融后磷酸化蛋 ...

请问封闭液为什么不能用脱脂牛奶呢？
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加油哦↖(^ω^)↗，O(∩_∩)O哈哈~
20楼2011-12-12 19:52:52
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