【答案】应助回帖

11楼2011-08-19 14:58:17

geek23

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11楼: Originally posted by noah1020 at 2011-08-19 14:58:17:
我用CST抗体做过p-erk~很好用的抗体~我用的药物刺激后peak出现在5min~你要真给药48h估计悬了...还是缩短暴露时间试试吧~还有就是，抗体可以在-20存，蛋白必须在-80，尤其是磷酸化的！在转膜的时候在转膜槽外面加一 ...

谢谢你的经验分享. 我主要做肝癌细胞. 而且检测过很多种磷酸化蛋白.前几次有检测出表达变化,比如p-cdc25c, p-cjun.用的是RIPA法裂解蛋白, PI 用的是罗氏的,加了磷酸酶抑制剂的.估计这几次的实验结果还是和蛋白的质量有关. 我还想问问你. 磷酸化蛋白检测,你一般上样量多少啊?

Bethechangeyouwishtosee.

12楼2011-08-19 15:03:42

noah1020

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★ ★
lstt09nk(金币+2): 感谢参与 2011-08-19 18:12:27

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12楼: Originally posted by geek23 at 2011-08-19 15:03:42:
谢谢你的经验分享. 我主要做肝癌细胞. 而且检测过很多种磷酸化蛋白.前几次有检测出表达变化,比如p-cdc25c, p-cjun.用的是RIPA法裂解蛋白, PI 用的是罗氏的,加了磷酸酶抑制剂的.估计这几次的实验结果还是和蛋白的 ...

我的上样量大，因为我用的是原代细胞~大概一个泳道上60ug的蛋白~按理说肝癌细胞比较皮实的，一般情况下癌症细胞内的蛋白会比较给力，也不那么脆弱~你再试试~

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13楼2011-08-19 15:13:41

geek23

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13楼: Originally posted by noah1020 at 2011-08-19 15:13:41:
我的上样量大，因为我用的是原代细胞~大概一个泳道上60ug的蛋白~按理说肝癌细胞比较皮实的，一般情况下癌症细胞内的蛋白会比较给力，也不那么脆弱~你再试试~

嗯嗯谢谢下次多注意一下有问题再请教

Bethechangeyouwishtosee.

14楼2011-08-19 15:18:59

wenjiji85

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我觉得磷酸化蛋白检测和总蛋白不差太多，不过有几点要注意：
1、磷酸化过程比较快，时间点确实不要太晚
2、提蛋白一定加蛋白酶抑制剂
3、封闭液不能用脱脂牛奶，得用BSA
4、蛋白最好不要冻融，冻融后磷酸化蛋白降解严重
5、有时候磷酸化蛋白是很弱，可以考虑用更强的ECL显色液试试。

15楼2011-11-13 15:18:30

wenjiji85

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呃，是磷脂酶抑制剂，打错了

16楼2011-11-13 15:19:53

linyingjia

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和普通的抗体一样量产的一般只能检测特定位点的自己找的可能不行

17楼2011-11-13 22:26:54

蓝天_1988

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封闭过夜，一抗时间长些。

18楼2011-11-17 15:36:59

bluecompass

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提取蛋白的时候做好加入磷酸酶抑制剂如氟化钠，钒酸钠等

19楼2011-11-19 20:33:07

zplipeng

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15楼: Originally posted by wenjiji85 at 2011-11-13 15:18:30:
我觉得磷酸化蛋白检测和总蛋白不差太多，不过有几点要注意：
1、磷酸化过程比较快，时间点确实不要太晚
2、提蛋白一定加蛋白酶抑制剂
3、封闭液不能用脱脂牛奶，得用BSA
4、蛋白最好不要冻融，冻融后磷酸化蛋 ...

请问封闭液为什么不能用脱脂牛奶呢？

加油哦↖(^ω^)↗，O(∩_∩)O哈哈~

20楼2011-12-12 19:52:52