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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » WB检测磷酸化蛋白
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zplipeng

金虫 (著名写手)
引用回帖:
1楼: Originally posted by geek23 at 2011-08-15 10:23:24:
各位大侠,有用过CST的磷酸化抗体检测磷酸化蛋白的吗?请问在整个提蛋白以及WB过程中有什么注意事项?小女最近做了几个抗体都没有条带.急~~~

楼主的磷酸化蛋白做出来了吗？
我做了很长时间都做不出磷酸化的表达
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21楼2011-12-12 20:00:38
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geek23

木虫 (小有名气)
引用回帖:
21楼: Originally posted by zplipeng at 2011-12-12 20:00:38:
楼主的磷酸化蛋白做出来了吗？
我做了很长时间都做不出磷酸化的表达

有几个做出来了,就是用楼上大侠建议的方法,把封闭液和抗体稀释液改成5%BSA了.不过还有几个没有做出来,估计和诱导表达的时间点有关系.你再按照楼上的建议试试,祝你好运.
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zplipeng
Bethechangeyouwishtosee.
22楼2011-12-13 09:01:01
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zplipeng

金虫 (著名写手)
送鲜花一朵
引用回帖:
22楼: Originally posted by geek23 at 2011-12-13 09:01:01:
有几个做出来了,就是用楼上大侠建议的方法,把封闭液和抗体稀释液改成5%BSA了.不过还有几个没有做出来,估计和诱导表达的时间点有关系.你再按照楼上的建议试试,祝你好运.

问几个比较细的问题：
1、楼主提取的细胞是贴壁的吗？是先消化再加裂解液还是直接向培养皿中加裂解液？我尝试了一下在培养皿（10cm）中加裂解液（300ul），因为不能加的少（盖不过来），最后提取的蛋白只有3mg/ml。而我先收集细胞后再加的裂解液，细胞浓度可以达到40mg/ml。但我担心收集细胞以及洗涤，冰冻裂解（液氮冰冻三次，因为没有超声波仪器）的过程会导致降解。可以说明您具体的提取方法吗？最好有详细的步骤
2、做蛋白磷酸化的PAGE时，楼主上样多少ul？每孔多少蛋白？我一开始做的时候一般每孔上样20uL（10uL蛋白+10uL Loadingbuffer），因为提取的蛋白浓度几乎为30-40ug/ul，所以跑出来的蛋白条带往往连在一起。导致内参检测成一条线。
3、楼主提取的蛋白现用嘛？还是在-80度保存？
4、楼主转膜的条件是什么？
谢谢啦。
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23楼2011-12-13 22:40:05
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geek23

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


silicare(金币+5, BioEPI+1): 谢谢参与 2012-02-20 12:45:53
引用回帖:
23楼: Originally posted by zplipeng at 2011-12-13 22:40:05:
问几个比较细的问题：
1、楼主提取的细胞是贴壁的吗？是先消化再加裂解液还是直接向培养皿中加裂解液？我尝试了一下在培养皿（10cm）中加裂解液（300ul），因为不能加的少（盖不过来），最后提取的蛋白只有3mg ...

1关于细胞裂解:我们一般先收集细胞再加入裂解液,裂解液的体积根据细胞的多少而定,不要太多,一般我们10厘米的盘子80%的细胞加200微升左右裂解液,然后裂解15-20分钟,每隔两分钟vortex一下(15s).然后13000rpm 离心30分钟,取上清.
2关于上样量:这个根据你要检测的蛋白在你细胞中的表达情况,一般表达量高达的,如PARP, SURVIVIN之类的我们就加40-50微克,而表达量低的我们也曾经加到100微克以上,当然了这个要求你的蛋白浓度相对较高,否则上样就是个问题.所以对于第一次做的蛋白,建议你先查文献,看看别人文献里报道该蛋白在特定细胞中的表达情况,再决定上样量.
3关于转膜:我们一般是恒压,100v转一个小时,100kd以上的就是一个半小时.注意电流不能太大,转膜槽里加转子,防止局部温度过高,必要时加冰壶,冰浴转膜.
4β-actin不好看的问题:这个和你的上样量还有上样体积有很大关系,如果体积过大的话,β-actin跑成一条线的问题很常见,我们经常遇到,个人觉得只要β-actin的量基本是一致的,好不好看不重要,呵呵 个人意见哈~
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zplipeng
Bethechangeyouwishtosee.
24楼2011-12-14 13:22:55
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张力民1598

铜虫 (小有名气)
CST的抗体还是很好用的，我觉得你加药物的事件有点长，磷酸化一般在加细胞因子刺激很短时间内就会发生，一般几分钟就够了，你要查查文献，看别人是怎么做的，另外，我们实验室做磷酸化都是提完蛋白立即就做western，样品反复冻融对检测磷酸化不太好。
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25楼2011-12-14 16:52:45
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zplipeng

金虫 (著名写手)
送鲜花一朵
引用回帖:
24楼: Originally posted by geek23 at 2011-12-14 13:22:55:
1关于细胞裂解:我们一般先收集细胞再加入裂解液,裂解液的体积根据细胞的多少而定,不要太多,一般我们10厘米的盘子80%的细胞加200微升左右裂解液,然后裂解15-20分钟,每隔两分钟vortex一下(15s).然后13000rpm 离心3 ...

非常感谢！
您提取的蛋白浓度有多少呢？
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26楼2011-12-14 23:37:02
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geek23

木虫 (小有名气)
引用回帖:
26楼: Originally posted by zplipeng at 2011-12-14 23:37:02:
非常感谢！
您提取的蛋白浓度有多少呢？

我们一般10mg/ml吧, 好像没有你提取的那么高.
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Bethechangeyouwishtosee.
27楼2011-12-15 08:41:56
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zplipeng

金虫 (著名写手)
引用回帖:
27楼: Originally posted by geek23 at 2011-12-15 08:41:56:
我们一般10mg/ml吧, 好像没有你提取的那么高.

您好！我现在已经把Erk1/2和p38的磷酸化做出来了。但奇怪的是未经过任何处理的阴性对照细胞也有磷酸化的激活，不知道是怎么回事啊。楼主遇到过这种问题吗？
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加油哦↖(^ω^)↗，O(∩_∩)O哈哈~
28楼2011-12-26 23:10:14
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geek23

木虫 (小有名气)
silicare(金币+3): 谢谢参与 2012-02-20 12:46:03
引用回帖:
28楼: Originally posted by zplipeng at 2011-12-26 23:10:14:
您好！我现在已经把Erk1/2和p38的磷酸化做出来了。但奇怪的是未经过任何处理的阴性对照细胞也有磷酸化的激活，不知道是怎么回事啊。楼主遇到过这种问题吗？

不知道和你的阴性对照比起来,是不是实验组的磷酸化程度更明显呢?一般我们用药物处理后,部分阴性对照组也会有磷酸化出现,细胞本底表达部分磷酸化激酶很常见.出现这种情况时你再去查一下文献,看看是不是该细胞本底就有该磷酸化蛋白的表达,.如果别人没有,估计就要从你的细胞状态入手了,最好是等到细胞长到对数生长期再处理.之前看一篇文献说,如果要加入药物处理,最好先将细胞用无血清培养基培养24h使细胞同步化,估计这样会使细胞间的误差减小吧,不过我还没试过,呵呵~~~
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Bethechangeyouwishtosee.
29楼2011-12-27 09:20:05
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vetzhangshen

铁虫 (初入文坛)
最近我也在做磷酸化的蛋白～也是跑了好多次了，条带是隐约有的，感觉条件很难摸啊～
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30楼2012-02-18 23:50:15
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