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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » WB检测磷酸化蛋白
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geek23

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

silicare(金币+3, BioEPI+1): 谢谢参与 2012-02-20 12:44:05
引用回帖:
30楼: Originally posted by vetzhangshen at 2012-02-18 23:50:15:
最近我也在做磷酸化的蛋白～也是跑了好多次了，条带是隐约有的，感觉条件很难摸啊～

建议1:在提取蛋白的时候加磷酸酶抑制剂
建议2:可以适当延长压片曝光时间.
建议3:加大上样量.
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Bethechangeyouwishtosee.
31楼2012-02-19 10:03:42
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vetzhangshen

铁虫 (初入文坛)
提取蛋白的时候，磷酸酶抑制剂也是加的，PMSF,NaF和Na3VO4都加了，上样量加到了150ug每孔，ECL发光之后还是看不见亮光啊，压片一般都压个二十分钟的~太苦恼了~
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32楼2012-02-19 16:44:52
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geek23

木虫 (小有名气)
引用回帖:
32楼: Originally posted by vetzhangshen at 2012-02-19 16:44:52:
提取蛋白的时候，磷酸酶抑制剂也是加的，PMSF,NaF和Na3VO4都加了，上样量加到了150ug每孔，ECL发光之后还是看不见亮光啊，压片一般都压个二十分钟的~太苦恼了~

你是药物处理后提取蛋白吗,如果是估计还要摸一下提蛋白的时间点, 有的蛋白磷酸化发生很迅速,很短暂的.
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Bethechangeyouwishtosee.
33楼2012-02-19 16:51:52
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lyqifeih

新虫 (小有名气)
silicare(金币+2): 谢谢参与 2012-02-20 12:44:41
楼主，做磷酸化蛋白WB，操作要小心，我经常做，不过我做的是组织里的蛋白磷酸化。我们一般是组织拿出来，立即液氮冷却后然后提取蛋白，老板再三要求的，里面有蛋白酶抑制剂和磷酸化酶抑制剂，这样做的原因主要是最大程度上减少阴性污染，活体组织，有时加裂解液也可以导致很多磷酸化产生，这样结果就不准确。个人建议，仅供参考！
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刚进入神经生物和电生理
34楼2012-02-20 09:15:55
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vetzhangshen

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
33楼: Originally posted by geek23 at 2012-02-19 16:51:52:
你是药物处理后提取蛋白吗,如果是估计还要摸一下提蛋白的时间点, 有的蛋白磷酸化发生很迅速,很短暂的.

哦，是的，我是药物处理之后提取的，嗯，谢谢你的意见，我准备把不同时间点的都提取出来做一下。
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35楼2012-02-22 10:48:59
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adams_zhao

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by geek23 at 2011-08-16 21:05:30:
大虾的回复真是太有用了!真的很谢谢!

请问您做出来了么？做出来的话传授一下经验可以么？
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36楼2012-03-07 11:58:33
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alicezzh

新虫 (初入文坛)
1、磷酸化蛋白的Western尽量用当天提取没有冻融的，否则磷酸化状态易于遭到破坏，检测不出
2、 蛋白抽提、封闭均需加入磷酸酶抑制剂
3、封闭液不能用脱脂奶粉，应用BSA
4、洗涤用TBST
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37楼2013-07-17 18:19:21
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alicezzh

新虫 (初入文坛)
另外，尽量做到无菌。我做的时候无论试剂盒器皿都是消毒或者一次性无菌的，因为细菌可以分泌或者携带磷酸酶，也能破坏磷酸化的状态
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38楼2013-07-17 18:22:14
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tupeipei

铜虫 (初入文坛)
反复冻融过三次三次应该没问题，我都很多次呢
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实验虐我千百遍，我待实验如初恋
39楼2013-11-26 18:56:21
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摩都520

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
39楼: Originally posted by tupeipei at 2013-11-26 18:56:21
反复冻融过三次三次应该没问题，我都很多次呢

38楼好，你是去年做的，还是想问下必须要加磷酸酶白抑制剂吗？有商品化的抑制剂？
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只做一件事，做绝
40楼2014-07-15 22:04:26
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