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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » WB检测磷酸化蛋白
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noah1020

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
silicare(金币+2, BioEPI+1): 谢谢参与 2011-08-19 15:13:52
我用CST抗体做过p-erk~很好用的抗体~我用的药物刺激后peak出现在5min~你要真给药48h估计悬了...还是缩短暴露时间试试吧~还有就是，抗体可以在-20存，蛋白必须在-80，尤其是磷酸化的！在转膜的时候在转膜槽外面加一个盆，放满冰，让转膜槽处于冰浴的状态~你提取蛋白的方法是什么？提取要是不注意的话，磷酸化蛋白很脆弱，会讲解的~我当时提取的时候用的是Roche公司的提取试剂盒，比较可靠~WB就是这样，如果你的蛋白很稳定很给力，拿做起来就会相当顺手；如果蛋白不是很牢靠的话，就会比较麻烦了~
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11楼2011-08-19 14:58:17
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geek23

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


silicare(金币+5, BioEPI+1): 谢谢参与 2012-02-20 12:45:53
引用回帖:
23楼: Originally posted by zplipeng at 2011-12-13 22:40:05:
问几个比较细的问题：
1、楼主提取的细胞是贴壁的吗？是先消化再加裂解液还是直接向培养皿中加裂解液？我尝试了一下在培养皿（10cm）中加裂解液（300ul），因为不能加的少（盖不过来），最后提取的蛋白只有3mg ...

1关于细胞裂解:我们一般先收集细胞再加入裂解液,裂解液的体积根据细胞的多少而定,不要太多,一般我们10厘米的盘子80%的细胞加200微升左右裂解液,然后裂解15-20分钟,每隔两分钟vortex一下(15s).然后13000rpm 离心30分钟,取上清.
2关于上样量:这个根据你要检测的蛋白在你细胞中的表达情况,一般表达量高达的,如PARP, SURVIVIN之类的我们就加40-50微克,而表达量低的我们也曾经加到100微克以上,当然了这个要求你的蛋白浓度相对较高,否则上样就是个问题.所以对于第一次做的蛋白,建议你先查文献,看看别人文献里报道该蛋白在特定细胞中的表达情况,再决定上样量.
3关于转膜:我们一般是恒压,100v转一个小时,100kd以上的就是一个半小时.注意电流不能太大,转膜槽里加转子,防止局部温度过高,必要时加冰壶,冰浴转膜.
4β-actin不好看的问题:这个和你的上样量还有上样体积有很大关系,如果体积过大的话,β-actin跑成一条线的问题很常见,我们经常遇到,个人觉得只要β-actin的量基本是一致的,好不好看不重要,呵呵 个人意见哈~
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zplipeng
Bethechangeyouwishtosee.
24楼2011-12-14 13:22:55
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geek23

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

silicare(金币+3, BioEPI+1): 谢谢参与 2012-02-20 12:44:05
引用回帖:
30楼: Originally posted by vetzhangshen at 2012-02-18 23:50:15:
最近我也在做磷酸化的蛋白～也是跑了好多次了，条带是隐约有的，感觉条件很难摸啊～

建议1:在提取蛋白的时候加磷酸酶抑制剂
建议2:可以适当延长压片曝光时间.
建议3:加大上样量.
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Bethechangeyouwishtosee.
31楼2012-02-19 10:03:42
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