应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » WB检测磷酸化蛋白
31/1返回列表
查看: 7600  |  回复: 41
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
本帖产生 3 个 BioEPI ，点击这里进行查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

noah1020

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
silicare(金币+2, BioEPI+1): 谢谢参与 2011-08-19 15:13:52
我用CST抗体做过p-erk~很好用的抗体~我用的药物刺激后peak出现在5min~你要真给药48h估计悬了...还是缩短暴露时间试试吧~还有就是，抗体可以在-20存，蛋白必须在-80，尤其是磷酸化的！在转膜的时候在转膜槽外面加一个盆，放满冰，让转膜槽处于冰浴的状态~你提取蛋白的方法是什么？提取要是不注意的话，磷酸化蛋白很脆弱，会讲解的~我当时提取的时候用的是Roche公司的提取试剂盒，比较可靠~WB就是这样，如果你的蛋白很稳定很给力，拿做起来就会相当顺手；如果蛋白不是很牢靠的话，就会比较麻烦了~
赞一下(1人) 回复此楼
11楼2011-08-19 14:58:17
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

智能机器人

Robot (super robot)

我们都爱小木虫

找到一些相关的精华帖子，希望有用哦~

科研从小木虫开始，人人为我，我为人人

geek23

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


silicare(金币+5, BioEPI+1): 谢谢参与 2012-02-20 12:45:53
引用回帖:
23楼: Originally posted by zplipeng at 2011-12-13 22:40:05:
问几个比较细的问题：
1、楼主提取的细胞是贴壁的吗？是先消化再加裂解液还是直接向培养皿中加裂解液？我尝试了一下在培养皿（10cm）中加裂解液（300ul），因为不能加的少（盖不过来），最后提取的蛋白只有3mg ...

1关于细胞裂解:我们一般先收集细胞再加入裂解液,裂解液的体积根据细胞的多少而定,不要太多,一般我们10厘米的盘子80%的细胞加200微升左右裂解液,然后裂解15-20分钟,每隔两分钟vortex一下(15s).然后13000rpm 离心30分钟,取上清.
2关于上样量:这个根据你要检测的蛋白在你细胞中的表达情况,一般表达量高达的,如PARP, SURVIVIN之类的我们就加40-50微克,而表达量低的我们也曾经加到100微克以上,当然了这个要求你的蛋白浓度相对较高,否则上样就是个问题.所以对于第一次做的蛋白,建议你先查文献,看看别人文献里报道该蛋白在特定细胞中的表达情况,再决定上样量.
3关于转膜:我们一般是恒压,100v转一个小时,100kd以上的就是一个半小时.注意电流不能太大,转膜槽里加转子,防止局部温度过高,必要时加冰壶,冰浴转膜.
4β-actin不好看的问题:这个和你的上样量还有上样体积有很大关系,如果体积过大的话,β-actin跑成一条线的问题很常见,我们经常遇到,个人觉得只要β-actin的量基本是一致的,好不好看不重要,呵呵 个人意见哈~
赞一下(1人) 回复此楼

» 本帖已获得的红花（最新10朵）

zplipeng
Bethechangeyouwishtosee.
24楼2011-12-14 13:22:55
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

geek23

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

silicare(金币+3, BioEPI+1): 谢谢参与 2012-02-20 12:44:05
引用回帖:
30楼: Originally posted by vetzhangshen at 2012-02-18 23:50:15:
最近我也在做磷酸化的蛋白～也是跑了好多次了，条带是隐约有的，感觉条件很难摸啊～

建议1:在提取蛋白的时候加磷酸酶抑制剂
建议2:可以适当延长压片曝光时间.
建议3:加大上样量.
赞一下 回复此楼
Bethechangeyouwishtosee.
31楼2012-02-19 10:03:42
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 geek23 的主题更新
31/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考博] 售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 +4 k0dTPqJtl0jt 2026-08-14 4/200 2026-08-15 01:40 by 4wMiSEwB6436
[硕博家园] 售SCI一区文章，我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急 +3 k0dTPqJtl0jt 2026-08-14 4/200 2026-08-15 01:28 by 4wMiSEwB6436
[基金申请] 各位道友，我要去昆明玩几天，回来见。 +7 Tide man 2026-08-14 8/400 2026-08-15 01:11 by arzu_hma
[教师之家] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +4 7lpolszZVXgi 2026-08-14 4/200 2026-08-15 01:08 by 4wMiSEwB6436
[考研] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +3 HFw0lei2R37i 2026-08-14 7/350 2026-08-15 00:40 by 4wMiSEwB6436
[考研] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可+急 +4 HFw0lei2R37i 2026-08-14 8/400 2026-08-15 00:16 by 4wMiSEwB6436
[基金申请] 奇怪，两个人的filecode固定段从头到尾一模一样 +8 布布和一二 2026-08-10 11/550 2026-08-14 14:58 by Equinoxhua
[论文投稿] 职称评审，求友友推荐见刊最快的期刊 +5 工厂打螺丝 2026-08-08 5/250 2026-08-14 11:03 by 玖戈弋
[基金申请] filecode +15 documentary 2026-08-10 17/850 2026-08-14 10:08 by kissu88
[基金申请] FileCode能看出啥？ +10 要乐观耀哥 2026-08-10 32/1600 2026-08-14 09:37 by 要乐观耀哥
[基金申请] 静等基金结果 +8 gjjjzhong 2026-08-10 21/1050 2026-08-13 17:56 by 且听虎啸
[基金申请] 重要来源：本周末出结果 +10 瞬息宇宙 2026-08-12 10/500 2026-08-13 15:46 by likettle
[基金申请] 结合人工智能，周易传统文化，filecode打分制来了，3分以上希望很大。 +3 Tide man 2026-08-12 4/200 2026-08-13 08:35 by ZJTJZ
[基金申请] 帮忙看看fileCode +7 wwncly 2026-08-10 13/650 2026-08-11 19:36 by 冰心玉壶晴
[基金申请] 为什么网上很多人说本周 12号出结果 +6 瞬息宇宙 2026-08-10 7/350 2026-08-11 19:25 by Tide man
[基金申请] 什么时候出结果，有咨询渠道？？？ +3 Tide man 2026-08-11 3/150 2026-08-11 17:54 by kudofaye
[基金申请] 确定了，国自然21号放榜 +6 布布和一二 2026-08-10 7/350 2026-08-10 19:15 by 2000zf36392
[基金申请] 据悉今年马上要出结果了 +7 瞬息宇宙 2026-08-10 8/400 2026-08-10 12:42 by Vivilian
[基金申请] 2026国自然放榜时间 +9 布布和一二 2026-08-08 9/450 2026-08-10 11:22 by xxxx2020
[基金申请] 关于filecode，很负责任的告诉大家 +6 爱看书的可乐 2026-08-08 7/350 2026-08-08 22:13 by a_niu
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭