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geek23

木虫 (小有名气)

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专业: 细胞信号转导

[求助] WB检测磷酸化蛋白

各位大侠,有用过CST的磷酸化抗体检测磷酸化蛋白的吗?请问在整个提蛋白以及WB过程中有什么注意事项?小女最近做了几个抗体都没有条带.急~~~

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Bethechangeyouwishtosee.

1楼 2011-08-15 10:23:24

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geek23

木虫 (小有名气)

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【答案】应助回帖

silicare(金币+5, BioEPI+1): 谢谢参与 2012-02-20 12:45:53

引用回帖:

23楼: Originally posted by zplipeng at 2011-12-13 22:40:05:
问几个比较细的问题：
1、楼主提取的细胞是贴壁的吗？是先消化再加裂解液还是直接向培养皿中加裂解液？我尝试了一下在培养皿（10cm）中加裂解液（300ul），因为不能加的少（盖不过来），最后提取的蛋白只有3mg ...

1关于细胞裂解:我们一般先收集细胞再加入裂解液,裂解液的体积根据细胞的多少而定,不要太多,一般我们10厘米的盘子80%的细胞加200微升左右裂解液,然后裂解15-20分钟,每隔两分钟vortex一下(15s).然后13000rpm 离心30分钟,取上清.
2关于上样量:这个根据你要检测的蛋白在你细胞中的表达情况,一般表达量高达的,如PARP, SURVIVIN之类的我们就加40-50微克,而表达量低的我们也曾经加到100微克以上,当然了这个要求你的蛋白浓度相对较高,否则上样就是个问题.所以对于第一次做的蛋白,建议你先查文献,看看别人文献里报道该蛋白在特定细胞中的表达情况,再决定上样量.
3关于转膜:我们一般是恒压,100v转一个小时,100kd以上的就是一个半小时.注意电流不能太大,转膜槽里加转子,防止局部温度过高,必要时加冰壶,冰浴转膜.
4β-actin不好看的问题:这个和你的上样量还有上样体积有很大关系,如果体积过大的话,β-actin跑成一条线的问题很常见,我们经常遇到,个人觉得只要β-actin的量基本是一致的,好不好看不重要,呵呵个人意见哈~