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geek23

木虫 (小有名气)

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[求助] WB检测磷酸化蛋白

各位大侠,有用过CST的磷酸化抗体检测磷酸化蛋白的吗?请问在整个提蛋白以及WB过程中有什么注意事项?小女最近做了几个抗体都没有条带.急~~~

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Bethechangeyouwishtosee.

1楼 2011-08-15 10:23:24

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zplipeng

金虫 (著名写手)

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引用回帖:

22楼: Originally posted by geek23 at 2011-12-13 09:01:01:
有几个做出来了,就是用楼上大侠建议的方法,把封闭液和抗体稀释液改成5%BSA了.不过还有几个没有做出来,估计和诱导表达的时间点有关系.你再按照楼上的建议试试,祝你好运.

问几个比较细的问题：
1、楼主提取的细胞是贴壁的吗？是先消化再加裂解液还是直接向培养皿中加裂解液？我尝试了一下在培养皿（10cm）中加裂解液（300ul），因为不能加的少（盖不过来），最后提取的蛋白只有3mg/ml。而我先收集细胞后再加的裂解液，细胞浓度可以达到40mg/ml。但我担心收集细胞以及洗涤，冰冻裂解（液氮冰冻三次，因为没有超声波仪器）的过程会导致降解。可以说明您具体的提取方法吗？最好有详细的步骤
2、做蛋白磷酸化的PAGE时，楼主上样多少ul？每孔多少蛋白？我一开始做的时候一般每孔上样20uL（10uL蛋白+10uL Loadingbuffer），因为提取的蛋白浓度几乎为30-40ug/ul，所以跑出来的蛋白条带往往连在一起。导致内参检测成一条线。
3、楼主提取的蛋白现用嘛？还是在-80度保存？
4、楼主转膜的条件是什么？
谢谢啦。